Ферментативная активность

Ферментативная активность микроорганизмов богата и разнообразна. По ней можно установить не только видовую и типовую принадлежность микроба, но и опреде­лить его варианты (так называемые биовары). Рассмот­рим основные ферментативные свойства и их качественное определение.

Расщепление углеводов (сахаролитическая активность), т. е. способность расщеплять сахара и многоатомные спирты с образованием кислоты или кислоты и газа, изучают на средах Гисса, которые содержат тот или иной углевод и индикатор. Под действием образующейся при расщеплении углевода кислоты индикатор изменяет окра­ску среды. Поэтому эти среды названы «пестрый ряд». Микробы, не ферментирующие данный углевод, растут на среде, не изменяя ее. Наличие газа устанавливают по образованию пузырьков в средах с агаром или по скопле­нию его в «поплавке» на жидких средах. «Поплавок» — узкая стеклянная трубочка с запаянным концом, обращен­ным вверх, которую до стерилизации помещают в пробир­ку со средой.

Кроме того, сахаролитическую активность изучают на средах Эндо, ЭМС, Плоскирева. Микроорганизмы, сбра­живая до кислоты находящийся в этих средах молочный сахар (лактозу), образуют окрашенные колонии — кислота изменяет цвет имеющегося в среде индикатора. Колонии микробов, не ферментирующих лактозу, бесцветны.

Молоко при росте микробов, сбраживающих лактозу, свертывается.

При росте микроорганизмов, образующих амилазу, на средах с растворимым крахмалом происходит его расщеп­ление. Об этом узнают, прибавив к культуре несколько капель раствора Люголя — цвет среды не изменяется. Нерасщепленный крахмал дает с этим раствором синее окрашивание.

Протеолитические свойства (т. е. способность расщеп­лять белки, полипептиды и т. п.) изучают на средах с желатином, молоком, сывороткой, пептоном. При росте на желатиновой среде микробов, ферментирующих жела­тин, среда разжижается. Характер разжижения, вызываемый разными микробами, различен. Микробы, расщепляющие казеин (молочный белок), вызывают пептонизацию молока —оно приобретает вид молочной сыво­ротки. При расщеплении пептонов могут выделяться индол, сероводород, аммиак. Их образование устанавлива­ют с помощью индикаторных бумажек. Фильтровальную бумагу заранее пропитывают определенными растворами, высушивают, нарезают узенькими полосками длиной 5 — 6 см. и после посева культуры на МПБ помещают под пробку между нею и стенкой пробирки. После инкубации в термостате учитывают результат. Аммиак вызывает посинение лакмусовой бумажки; при выделении сероводо­рода на бумажке, пропитанной 20% раствором свинца ацетата и натрия гидрокарбоната, происходит образование свинца сульфата — бумажка чернеет; индол вызывает пок­раснение бумажки, пропитанной раствором щавелевой кислоты.

Помимо указанных сред, способность микроорганиз­мов расщеплять различные питательные субстраты опре­деляют с помощью бумажных дисков, пропитанных опре­деленными реактивами (системы индикаторные бумажные «СИБ»). Эти диски опускают в пробирки с исследуемой культурой и уже через 3 ч инкубации в термостате при 37 °С по изменению цвета дисков судят о разложении углеводов, аминокислот, белков и т. д.

Гемолитические свойства (способность разрушать эрит­роциты) изучают на средах с кровью. Жидкие среды при этом становятся прозрачными, а на плотных средах вокруг колонии появляется прозрачная зона. При образовании метгемоглобина среда зеленеет.

СОХРАНЕНИЕ КУЛЬТУР

Выделенные и изученные культуры (штаммы), пред­ставляющие ценность для науки или производства, хранят в музеях живых культур. Общесоюзный музей находится в Государственном НИИ стандартизации и контроля меди­цинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича (ГИСК).

Задача хранения — поддержать жизнеспособность микроорганизмов и предупредить их изменчивость. Для этого надо ослабить или прекратить обмен в микробной клетке.

Один из самых совершенных методов длительного сохранения культур — лиофилизация — высушивание в вакууме из замороженного состояния позволяет создать состояние анабиоза. Высушивание проводят в специальных аппаратах. Хранят культуры в запаянных ампулах при температуре 4 °С, лучше при -30—70 °С.

Восстановление высушенных культур.

Сильно нагрева­ют кончик ампулы в пламени горелки и прикасаются к нему ватным тампоном, слегка смоченным холодной водой, чтобы на стекле образовались микротрещины, через которые воздух медленно просочится внутрь ампу­лы. При этом, проходя через разогретые края трещин, воздух стерилизуется.

Не забывайте, что в запаянной ампуле вакуум. Если воздух в нее попадает сразу через большое отверстие, может распылить­ся находящаяся в ампуле культура и произойти ее выброс.

Дав войти воздуху, быстро пинцетом надламывают и удаляют верхушку ампулы. Слегка обжигают отверстие и стерильной пастеровской пипеткой или шприцем вносят в ампулу растворитель (бульон или изотонический раствор). Перемешивают содержимое ампулы и засевают на среды. Рост восстановленных культур в первых посевах может быть замедлен.

Длительно сохранять культуры Можно также в жидком азоте (-196 °С) в специальных приборах.

Методы непродолжительного сохранения культур следу­ющие: 1) субкультивирование (периодические пересевы на свежие среды) с интервалами, зависящими от свойств микроорганизма, среды и условий культивирования. Меж­ду пересевами культуры хранят при 4 °С; 2) сохранение под слоем масла. Культуру выращивают в агаре столби­ком высотой 5—6 см, заливают стерильным вазелиновым маслом (слой масла примерно 2 см) и хранят вертикально в холодильнике. Сроки хранения у разных микроорганиз­мов разные, поэтому из пробирок периодически высевают культуру, чтобы проверить ее жизнеспособность; 3) хра­нение при -20—70 °С; 4) хранение в запаянных пробир­ках. По мере надобности сохраняемый материал высевают на свежую среду.

Глава 8. ФАГИ

Фаги — вирусы бактерий и ряда других микроорганиз­мов. В определенных условиях они вызывают лизис (растворение) своих хозяев. Действие фагов проявляется в природе и используется в практике.

Рис.42 Бактериофаги

История открытия и изучения фага. В 1898 г. Н. Ф. Га­малея показал, что фильтрат сибиреязвенных бацилл вызывает лизис свежих культур этих микроорганизмов, В 1915 г. Ф. Ту орт обнаружил, что белые непрозрачные колонии стафилококков становились прозрачными и исче­зали и что агент, лизирующий стафилококки, проходит через бактериальные фильтры, сохраняя способность ра­створять свежие культуры микроорганизмов. Явление лизиса микроорганизмов было описано, но природа его не изучена. Вот почему честь открытия бактериофага принадлежит канадскому ученому д'Эреллю.

Д'Эрелль (1917) изучал фильтраты испражнений, кото­рые брал ежедневно у больного дизентерией и вносил в пробирки со свежезасеянной культурой возбудителя этой болезни. После инкубации в термостате культура выраста­ла. Но однажды она не выросла, а растворилась. Это совпало с началом выздоровления больного.

Д'Эрелль показал, что лизирующая способность фильтратов испражнений усиливалась при последовательных пассажах на свежих культурах бактерий. Из этого ученый сделал вывод, что растворяет их живой агент, проходящий через бактериальные фильтры, т. е. вирус. В настоящее время его точка зрения принята большинством ученых.

Открытый вирус д'Эрелль назвал бактериофагом— пожирателем бактерий (от греч. фагос —пожирающий), а явление — бактериофагией.

С открытием электронного микроскопа была подтвер­ждена корпускулярная природа фага и изучена его морфо­логия.

Открытие д'Эрелля привлекло внимание врачей, применивших фаг для лечения и профилактики ряда инфекцион­ных болезней. В настоящее время фаги широко использу­ют в медицинской практике и при различных биологиче­ских исследованиях. Фагами занимаются бактериологи, вирусологи, биохимики, генетики, биофизики, молекулярные биологи, экспериментальные онкологи, специалисты по генной инженерии и биотехнологии и т. д. Изучение фага продолжается, как одна из интереснейших глав биологии.

СВОЙСТВА ФАГОВ

Природа фагов. Фаги, как считает большинство исследователей,— это организмы, которые подобно всем живым организмам способны размножаться, передавать потом­ству свои свойства и изменяться под воздействием различ­ных факторов. Они могут инфицировать, только молодые развивающиеся клетки, являясь их паразитами.

Морфология фагов. Большинство фагов состоит из головки и хвостового отростка, поэтому их сравнивают с головастиками или сперматозоидами. Наиболее изучены Т-фаги кишечной палочки). Их отросток представ­ляет собой полый цилиндр (стержень), покрытый чехлом и заканчивающийся базальной пластинкой с шипами и фиб­риллами. Размеры фагов, форма и величина головки, длина и строение отростка различны у разных фагов. Например, встречаются фаги с длинным отростком, чехол которого не сокращается, фаги с коротким отростком, без отростка и нитевидные

Химический состав фагов. Как и все вирусы, фаги состоят из нуклеиновой кислоты одного типа (чаще встречаются ДНК-фаги) и белка. Молекула нуклеиновой кислоты, скрученная в спираль, находится в головке фага. Оболочка фага (капсид) и отросток имеют белковую природу. На свободном конце отростка содержится литический фермент, обычно лизоцим или гиалуронидаза.

Специфичность фагов. Фаги обладают строгой специ­фичностью. Различают видовую специфичность, т. е. способность паразитировать только в определенном виде микроорганизмов. Именуют фаги обычно по названию микроба-хозяина (стрептококковый, стафилококковый, холерный, дизентерийный и т. д.). Фаги с более строгой специфичностью паразитируют только на определенных представителях данного вида — это типовые фаги. Фаги, лидирующие микроорганизмы близких видов, например видов, входящих в род возбудителей дизентерии (шигелл), называются поливалентными.

Взаимодействие фага с чувствительной клеткой прохо­дит через последовательные стадии. Весь цикл занимает в разных системах фаг —бактерия от нескольких минут до 1—2 ч. Разберем последовательность этого процесса на примере Т-четного фага кишечной палочки.

Стадия I — адсорбция частиц фага на поверхно­стных рецепторах клетки осуществляется с помощью нитей хвостового отростка. На одной клетке могут адсор­бироваться сотни фагов (для лизиса клетки достаточно одного). Адсорбция фагов специфична.

Стадия II — проникновение (инъекция) нуклеино­вой кислоты фага в клетки у разных фагов происходит по-разному. У Т-фагов кишечной палочки шипы базальной пластинки соприкасаются с клеточной стенкой. Стержень «прокалывает» клеточную стенку. Фермент, находящийся в отростке, чаще всего лизоцим, разрушает цитоплазматическую мембрану. При этом чехол отростка сокращается, и через канал стержня нуклеиновая кислота фага «впры­скивается» в клетку. Пустая белковая оболочка фага («тень») остается снаружи.

Стадия III — репродукция белка и нуклеиновой кислоты фага внутри клетки.

Стадия IV — сборка и формирование зрелых частиц фага.

Рис.43 Строение фага.

1 — головка; 2 — ДНК; 3 — стержень; 4 — чехол; 5 — базальная пластинка; 6—шипы; 7 — хвостовые фибриллы.

Рис.44 Морфология фагов.

1— фаги с головкой, отро­стком и сокращающимся чех­лом; 2—-головка и отросток, без сократительной способно­сти ; 3 — головка и короткий отросток; 4 —бесхвостые фа­ги; 5-—нитевидные фаги.

Стадия V—лизис клетки и выход зрелых частиц фага из нее. Обычно происходит разрыв клеточной стенки и в окружающую среду выходит несколько сот новых фагов, способных поражать свежие клетки. Такой лизис называется лизисом изнутри.

В отличие от лизиса изнутри лизис извне происходит тогда, когда на клетке адсорбируется сразу очень боль­шое количество фагов. Они проделывают в клеточной стенке многочисленные отверстия, через которые вытека­ет содержимое клетки. Таким образом, при лизисе извне фаг не размножается, и количество его частиц не увеличи­вается.

По характеру действия на микроорганизмы различают вирулентные и умеренные фаги.

Вирулентные фаги вызывают лизис зараженной клетки с выходом в окружающую среду большого количе­ства фаговых частиц, способных поражать новые клетки. При этом культура микроорганизмов лизируется. Жидкая среда становится прозрачной — происходит образование фаголизата — среды, в которой находится большое количество фагов. При развитии вирулентного фага в бактериях, растущих на плотной среде, образуются или прозрачные участки сплошного лизиса, или вырастают отдельные прозрачные образования — колонии фага. Их называют негативными колониями (бляшками). Колонии — разных фагов отличаются по величине и структуре.

Умеренные фаги лизируют не все клетки в популя­ции. С частью из них фаги вступают в симбиоз: нуклеиновая кислота фага (его геном) встраивается в хромосому клетки и получает название про Фаг. Проис­ходит образование единой хромосомы. Бактериальная клетка при этом не погибает. Профаг, ставший частью генома клетки, при ее размножении может передаваться неограниченному числу потомков, т. е. новым клеткам. Явление симбиоза микробной клетки с умеренным фагом (профагом) носит название л и з о г е н и я, а культура, в которой имеется про фаг, называется лизогенной. Это название отражает способность профага спонтанно поки­дать хромосому клетки и, переходя в цитоплазму, превра­щаться в вирулентный фаг. Те клетки культуры, в которых образовался вирулентный фаг, погибают (лизируются), остальные сохраняют лизогенность.

Рис.45

Схема основных этапов взаимодействия фага с бактери­альной клеткой.

1 – внедрение нуклеиновой кислоты фага в клерку; 2—молодые, размножающиеся

фаги; 3 —зрелые фаги; 4 — выделение фагов.

Лизогенные культуры по своим основным свойствам не отличаются от исходных, но они устойчивы к повторному заражению одноименным фагом. При действии на лизогенную культуру проникающего излучения (определенных доз и экспозиции рентгеновских, космических лучей), некоторых химических веществ и ряда других факторов продукция вирулентного фага и лизис им клеток культуры значительно увеличиваются.

Умеренные фаги могут принести вред микробиологиче­скому производству. Например, если штаммы-продуценты вакцин, антибиотиков и других биологических веществ оказываются лизогенными, существует опасность перехо­да умеренного фага в вирулентный, что повлечет за собой лизис производственного штамма.

Умеренные фаги являются мощным фактором измен­чивости микроорганизмов. Профаг может изменить некоторые свойства микробной культуры, например сделать ее способной к токсинообразованию, что наблюдается среди дифтерийных палочек, возбудителя скарлатины и др. Кроме того, переходя в вирулентную форму и лизируя клетку, фаг может захватить часть хромосомы клетки-хозяина и перенести эту часть хромосомы в другую клетку, где фаг снова перейдет в профаг, а клетка получит новые свойства.

Распространение фагов в природе повсеместное. Фаги встречаются там, где находятся чувствительные к ним микроорганизмы: в воде, почве, сточных водах, выделени­ях человека и животных и т. д. Почти все известные бактерии являются хозяевами специфических для них фагов.

Устойчивость фагов к физическим и химическим факто­рам выше, чем у вегетативных форм их хозяев. Фаги выдерживают нагревание до.75°С, длительное высушива­ние, рН от 2,0 до 8,5. Они не чувствительны к антибиоти­кам, тимолу, хлороформу и ряду других веществ, уничто­жающих сопутствующую микрофлору. Поэтому эти веще­ства используют при выделении и сохранении фагов. Кислоты и дезинфицирующие вещества губительны для фагов.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ФАГОВ

Применение фагов основано на их строгой специфично­сти и способности разрушать микробные клетки или вступать с ними в симбиоз.

Фагопрофилактика и фаготерапия—предупреждение и лечение инфекций с помощью фагов основаны на том, что, встречая в организме больного возбудителя болезни, фаг уничтожает его. В настоящее время фаги широко применяют при лечении и профилактике стафилококковых и стрептококковых поражений, даже таких, которые не поддаются действию антибиотиков, а также холеры, чумы и ряда других инфекций, например, инфекций, вызванных кишечной палочкой и протеем.

Фагодиагностика включает: а) идентификацию выде­ленных культур с помощью известных (диагностических) фагов. Культура соответствует тому фагу, который ее лизировал. Например, если лизис вызвал холерный фаг, то это культура холерного вибриона. Строгая специфич­ность типовых фагов дает возможность типировать вари­анты внутри вида (фаговары). Фаготипирование имеет большое значение в эпидемиологии, так как позволяет установить источник инфекции и решить ряд других вопросов; б) определение неизвестного фага по тест-культуре микробов. Если фаг лизирует культуру возбудителя дизентерии, то это дизентерийный фаг; в) ускоренный метод диагностики с помощью реак­ции нарастания титра фага РНТФ не требует выделения чистой культуры возбудителя. Исследуемый материал (от больного или из объектов внешней среды) и индикаторный фаг, титр которого строго установлен, вносят в бульон.

Умеренные фаги широко применяют при решении кардинальных вопросов биологии. С их помощью изучен генетический код, достигнуты большие успехи в генной инженерии, их используют для изучения опухолевого роста, как фактор изменчивости микроорганизмов и в других исследованиях. Так как лизогенные культуры в отличие от «здоровых» чувствительны к радиации, они служат для определения надежности защиты космических кораблей от космических лучей: при ненадежной защите профаг переходит в вирулентную форму и лизирует культуру.

ПРЕПАРАТЫ ФАГОВ

При производственном получении препаратов фага пользуются хорошо изученными штаммами микроорганизмов и фагов, которые обычно выращивают в реакторах, что позволяет получать большие количества фаголизата.

Фаги выпускают в жидком виде (ампулы и флаконы ), в таблетках и свечах. Таблетка фагов, предназначенные для применения через рот, покрыты кислотоустойчивой оболочкой, защищающей фаги от действия соляной кислоты желудочного сока.

Все препараты фагов подлежат обязательному контролю на отсутствие посторонней флоры, безвредность и активность (титр), который осуществляется на выпускающем их производстве. Выборочный контроль производят в Государственном НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича. Выпускаемый фаг снабжен этикеткой, на которой указано: учреждение, его выпускающее, название фага, серия, номер контроля и срок годности. Каждая упаковка снабжена наставлением по применению и хранению фага.