Рецепты приготовления простых

(основных) сред и изотонического

раствора натрия хлорида

Изотонический раствор натрия хлорида. К 1л дистиллированной воды добавляют 9 г натрия хлорида. Раствор фильтруют, устанавливают заданный рН и, если нужно, стерилизуют при 120 °С в течение 30 мин.

Мясопептонный бульон (МПБ). К мясной воде прибавляют 1% пептона и 0,5% х. ч. натрия хлорида, кипятят на слабом огне 10—15 мин. для растворения веществ, устанавливают нужный рН и снова кипятят 30—40 мин. до выпадения осадка. Фильтруют, доливают до первоначаль­ного объема водой и стерилизуют 20 мин. при 120 °С.

Бульон Хоттингера. Перевар Хоттингера разводят водой в 5—6 раз в зависимости от того, какое количество аминного азота он содержит и какое его количество должно быть в бульоне (указано в паспорте перевара и рецепте среды). Например, для приготовления среды с 1,2 г/л аминного азота перевар, содержащий 9,0 г/л, надо развести в 7,5 раз (9,0:1,2). К разведенному перевару прибавляют 0,5% натрия хлорида и кипятят на слабом огне до растворения соли. В остывшей среде устанавливают рН, фильтруют, разливают и стерилизуют 20 мин. при 120˚С

Мясопептонный агар (МПА). К готовому бульону (до стерилизации или после нее) добавляют 2—3% измельченного агар-агара и кипятят, помешивая, на слабом огне до полного расплавления агара. МПА можно варить в автоклаве или аппарате Коха. Готовую среду, если нужно, осветляют, фильтруют и стерилизуют 20 мин. при 120 °С.

Полужидкий агар содержит 0,4—0,5% агар-агара.

Питательный желатин. К готовому бульону прибавляют 10—15% желатина, подогревают до его расплавления (не кипятят!), разливают в стерильную посуду и стерилизуют текучим паром.

Рецепты приготовления сложных сред

Среды с углеводами. К основному бульону или расплавленному агару прибавляют нужное количество (0,1 — 2%) определенного углевода (например, глюкозы). После его растворения разливают в стерильную посуду и стерилизуют текучим паром. Поскольку углеводы частично разрушаются даже при таком режиме стерилизации, предпочтитель­нее 25—30% раствор углеводов, простерилизованный через бактериальный фильтр, добавлять в нужном объеме с соблюдением асептики к
стерильным основным средам — после контроля стерильности среда
готова к употреблению.

Среды с кровью готовят из стерильных простых сред, добавляя в асептических условиях (лучше в боксе) от 5 до 30% (обычно 5%) стерильной дефибринированной крови. Агаровые среды перед этим растапливают и остужают до 45 °С. Определяют температуру среды, поднося сосуд к шее у угла нижней челюсти. При нужной температуре должно быть терпимое ощущение горячего, но не ожога. После добавления крови, пока среда не застыла, содержимое сосуда тщательно перемешивают и разливают в чашки или пробирки.

Внимание! Среды с кровью растапливать нельзя — кровь изменит свои свойства.

Среды с сывороткой крови готовят так же, как среды с кровью. К основным средам добавляют 10—20% сыворотки, не содержащей кон­серванта и предварительно инактивированной при 56 °С в течение 30 мин на водяной бане или в инактиваторе. При инактивации разрушается вещество (комплемент), губительно действующее на микробы.

Среды с желчью. К простым средам добавляют желчь в количестве —40% объема среды, устанавливают нужный рН и стерилизуют 20 мин. при 120 °С. Можно стерильную желчь добавить к стерильной среде в асептических условиях.

Разлив агаровых сред в чашки Петри. Среды перед разливом расплавляют на водяной бане и остужают до 45—50 °С. Обычно для чашки диаметром 9 см достаточно 15—20 мл среды (высота слоя 0,25—-0,3 см). Если слой выше, на нем менее контрастно выглядят колонии. При очень тонком слое резко ограничено количество питатель­ных веществ и влаги (среда быстро высыхает) — ухудшаются условия культивирования.

Разливают среды в стерильные чашки в асептических условиях. Чашки ставят крышкой вверх. Сосуд со средой берут в правую руку, держа его у огня. Левой рукой вынимают пробку, зажав ее мизинцем и ладонью. Обжигают горлышко сосуда и двумя пальцами левой руки слегка приоткрывают крышку. Вводят под нее горлышко флакона, не прикасаясь им к краю чашки. Наливая среду, следят чтобы она равномерно распределилась по дну чашки. Если при разливе на повер­хности среды образуются пузырьки воздуха, к ним до того, как среда застынет, подносят пламя спички или горелки—пузырьки лопнут. Затем чашку закрывают и дают среде застыть. Если посев производят в день разлива, среду необходимо подсушить. Для этого чашки в термостате осторожно открывают и устанавливают крышки и чашки открытой стороной вниз на 20—30 мин. Если посев производят на следующий день после разлива, чашки, не подсушивая, завертывают в ту же бумагу, в которой их стерилизовали, и помещают в холодильник.

Приготовление скощенного агара. Пробирки с 4—5 мл стерильной расплавленной агаровой среды укладывают в наклонном положении (примерно под углом 20°) с таким расчетом, чтобы среда не заходила за ²/₃ пробирки, иначе она может смочить пробку. После того как среда застынет, пробирки ставят вертикально — дают стечь конденсату. Лучше употреблять свежескошенный агар.

Внимание! Пользоваться средой, в которой нет конденсата, нельзя. Её следует снова растопить на водяной бане и скосить.

Сухие среды

Отечественная промышленность выпускает сухие сре­ды разного назначения: простые, элективные, дифферен­циально-диагностические, специальные. Это порошки во флаконах с завинчивающимися крышками. Хранят сухие среды в темном месте плотно закрытыми — они гигроско­пичны. В лаборатории из порошков готовят среды по прописи на этикетке.

Рис.40 Весы

Преимущество сухих сред по сравнению со средами, изготовленными в лаборатории, — стандартность (их выпу­скают большими партиями), простота приготовления, де­лающая их доступными в любых (даже походных) услови­ях, стабильность, экономичность. Важно, что их можно готовить из заменителей мяса: гидролизата казеина, фиб­рина, кильки и даже белковых фракций микробных клеток (сарцин).

МЕТОДЫ ПОСЕВОВ

Важным этапом бактериологического исследования яв­ляется посев. В зависимости от цели исследования, характера посевного материала и среды используют раз­ные методы посева. Все они включают обязательную цель: оградить посев от посторонних микробов. Поэтому работать следует быстро, но без резких движений, усили­вающих колебания воздуха. Во время посевов нельзя разговаривать. Посевы лучше делать в боксе.

Не забывайте выполнять правила личной безопасности при работе с заразным материалом.

Посев из пробирки в пробирку. Пробирку с посевным материалом и пробирку со средой держат слегка наклонно в левой руке между большим и указательным пальцами так, чтобы края пробирок были на одном уровне, а их основания находились поверх кисти, обычно пробирку с посевным материалом держат ближе к себе. В правой руке, как писчее перо, держат бактериальную петлю, и стерилизуют ее, держа вертикально в пламени горелки. Мизинцем и краем ладони правой руки вынимают обе пробки одновременно. Извлекают пробки не рывком, а плавно — легкими винтовыми движениями. Вынув пробки, края проби­рок обжигают в пламени горелки. Прокалённую петлю вводят через пламя горелки в пробирку с посевным материалом, охлаждают и, набрав немного материала, осторожно переносят в пробирку со средой.

При посеве в жидкую среду посевной материал растирают на стенке пробирки над жидкостью и смывают средой.

При посеве на жидкие среды тампоном его погружают в среду и 3—5 с ополаскивают в ней. При посеве на плотную среду материал втирают в ее поверхность, вращая тампон, после чего тампон обеззара­живают (помещают в пробирку, в которой он был доставлен в лаборато­рию, и автоклавируют).

Следите, чтобы среда не вылилась и не смочила пробку.

При посеве на скошенный агар материал обычно растирает на поверхности среды зигзагообразными движениями снизу вверх, начиная от границы конденсата.

При посеве на плотные среды, разлитые в пробирки столбиком, петлей с посевным материалом прокалывают столбик, производя так называемый посев «уколом».

После посева петлю извлекают из пробирки, края пробирок обжига­ют и, проведя пробки через пламя горелки, закрывают пробирки, после чего прокаливают петлю.

Посев жидкого материала можно производить стерильными пипетка­ми (пастеровскими или градуированными). После посева пипетки погру­жают в дезинфицирующую жидкость.

Посевы во флаконы, матрацы и бутыли производят примерно так, как в пробирки, только сначала набирают материал (петлей или в пипетку), а потом открывают сосуд со средой.

Сосуды с засеянной культурой надписывают и ставят в термостат.

Посев на пробирки с чашки Петри. Изучив характер роста культуры на чашке, со стороны дна отмечают восковым карандашом нужный для посева участок. Чашку с посевным материалом ставят перед собой крышкой вверх. Левой рукой приоткрывают крышку и вводят под нее обожженную петлю. Остудив петлю, набирают посевной материал с отмеченного участка. Вынимают петлю, закрывают чашку и в левую руку берут пробирку со средой. Посев производят так же, как с пробирки в пробирку. После посева чашку поворачивают вверх дном.

Посев на агар в чашки Петри. Посев шпателем. Шпатель — это стеклянная или металлическая трубочка, конец которой загнут в виде треугольника. Шпатель можно сделать из пастеровской пипетки, согнув под углом ее тонкий конец, предварительно разогретый в пламени горелки.

Левой рукой слегка приоткрывают крышку, держа ее большим и указательным пальцем. Петлей, пипеткой или стеклянной палочкой наносят на поверхность среды посевной материал, после чего тщательно втирают его круговыми движениями шпателя до тех пор, пока шпатель не перестанет свободно скользить по поверхности среды, левой рукой при этом придерживают крышку и одновременно вращают чашку. По окончании посева шпатель вынимают из чашки и закрывают крышку. Стеклянный шпатель помещают в дезинфицирующий раствор, а металли­ческий прокаливают в пламени горелки.

Посев петлей. Небольшое количество посевного материала (ино­гда его предварительно эмульгируют в стерильном изотоническом растворе или бульоне) втирают петлей в поверхность среды у края чашки, несколько раз проводя петлей из стороны в сторону. Затей у того места, где закончились штрихи, агар прокалывают петлей, снимая избыток посевного материала. Оставшийся на петле посевной материал зигзагообразными движениями распределяют по всей поверхности сре­ды. По окончании посева закрывают чашку и прожигают петлю.

Посев петлей на секторы. Чашку со стороны дна расчерчива­ют на секторы. Посев производят зигзагообразными движениями от края чашки к центру. Необходимо следить, чтобы штрихи не заходили на соседний сектор.

Посев тампоном. Тампон с посевным материалом вносят в слегка приоткрытую чашку и круговыми движениями втирают его содержимое в поверхность среды, вращая при этом тампон и чашку.

Подсев газоном. Примерно 1 мл (20 капель) жидкой культуры (если культура с плотной среды, ее эмульгируют в стерильном изотони­ческом растворе или бульоне) наносят на поверхность агара и тщательно распределяют жидкость по поверхности среды. Чашку слегка наклоняют и пипеткой отсасывают избыток культуры, выливая ее в дезинфициру­ющий раствор. Туда же помещают пипетку.

Посев в толщу агара. Культуру, выращенную на жидкой среде, или эмульгированный материал вносят в сосуд с расплавленным и остуженным до 45°С агаром, перемешивают и выливают в стерильную чашку Петри. Можно внести посевной материал в пустую чашку и залить 15—20 мл остуженного до 45°С агара. Для перемешивания содержимого чашки ее слегка покачивают и вращают. Чашки оставляют на столе до застывания среды.

Засеянные чашки подписывают со стороны дна и помещают в термостат дном вверх.

МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

Для успешного культивирования, помимо правильно подобранных сред и правильно произведенного посева, необходимы оптимальные условия: температура, влаж­ность, аэрация (снабжение воздухом). Как правило, подхо­дящие условия удается создать, тщательно воспроизведя условия природной обстановки.

Температура. Оптимальную температуру для культиви­рования большинства патогенных микроорганизмов (37°С) создают в термостате. Это прибор с двойными стенками, между которыми находится воздух или вода, подогреваемые электричеством. Он снабжен терморегуля­тором, автоматически поддерживающим нужную темпера­туру, и термометром для контроля за температурой.

Пробирки с посевами в штативах, проволочных сетках или банках устанавливают на полках термостата. Чашки в термостате должны стоять вверх дном. Чтобы воздух в термостате свободно циркулировал и нагрев был равно­мерным, полки в термостате делают с прорезями и плотно не загружают. Чтобы не охладить культуры, термостат не оставляют надолго открытым.

Лаборант обязан ежедневно регистрировать температу­ру в термостате и поддерживать чистоту в приборе, а при неисправности вызвать мастера.

Свет подавляющему большинству микробов (к ним относятся все патогенные) не нужен — их культивируют в темноте. Однако для изучения пигментообразования, ко­торое происходит активнее на рассеянном свету, культуры после термостата выдерживают 2 — 3 дня при комнатном освещении.

Влажность. Жизнь микробов невозможна без влаги — питательные вещества проникают в клетку только в растворенном виде. Это необходимо учитывать при куль­тивировании на плотных средах: разливать их в чашки и скашивать в пробирках лучше в день посева. При культи­вировании микробов, особенно чувствительных к отсут­ствию влаги, например гонококков, в термостат ставят открытый сосуд с водой.

Сроки культивирования. Большинство патогенных микробов культивируют 18—24 ч, но есть виды, растущие медленно (до 4—6 нед). Чтобы сохранить в них влагу, ватные пробки после посева заменяют стерильными рези­новыми или надевают на них резиновые колпачки.

Аэрация. По потребности микробов в свободном кисло­роде их делят на аэробы и анаэробы. Обе группы требуют различных условий культивирования.

Поступление кислорода, необходимого для культиви­рования аэробов и факультативных анаэробов, осуще­ствляется при пассивной и активной аэрации.

Пассивная аэрация — это культивирование на плот­ных и жидких средах в сосудах, закрытых ватными или ватно-марлевыми пробками, или в чашках Петри. При таком культивировании,_s микробы потребляют кислород, растворенный в среде, находящийся в сосуде над средой и поступающий через пробку. Пассивно аэрируемые культу­ры можно выращивать на поверхности или в тонком слое среды, куда проникает кислород воздуха.

Активную аэрацию применяют при глубинном куль­тивировании микробов, когда их выращивают в больших объемах среды. Чтобы достаточно снабдить кислородом такие культуры, их помещают в специальные качалки — постоянное перемешивание культуры обеспечивает сопри­косновение ее с воздухом. При культивировании в объ­емах жидкости, достигающих десятков и сотен литров, проводимом в приборах, называемых реакторами , воздух продувают через культуру при помощи специальных устройств.

Культивирование анаэробов сложнее, чем аэробов, так как их необходимо лишить доступа свободного кислорода воздуха. Для этого удаляют воздух из питательной среды различными способами.

Культивирование актиномицетов, грибов, микоплазм, L-форм, спирохет и простейших. Культивирование этих микроорганизмов принципиально сходно с культивирова­нием бактерий. Для них разработаны специальные среды и подобраны режимы, соответствующие их потребностям.

Культивирование риккетсий и вирусов. Риккетсии и вирусы являются облигатными паразитами, т. е. могут развиваться только в живых клетках. Их культивируют в культурах тканей, организме экспериментальных жи­вотных, развивающихся куриных эмбрионах.

МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР МИКРООР-

ГАНИЗМОВ

Чистой культурой называют скопление микробов одного вида на плотной или в жидкой питательной среде.

Существует ряд методов выделения чистой культуры в зависимости от свойств изучаемого материала и цели исследования. Обычно чистые культуры получают из изолированных колонии — обособленных скоплений микробов на плотной среде. Считают, что чаще всего колония развивается из одной микробной клетки, т. е.
является чистой культурой этого микроорганизма.

Этапы выделения чистой культуры:

1-й день — получение изолированных колоний. Каплю исследуемого материала петлей, пипеткой или стеклянной палочной наносят на поверхность агара в чашке Петри. Шпателем втирают материал в поверхность среды; не прожигая и не перевертывая шпателя, производят посев на 2-й, а затем на 3-й чашке. При таком посеве на 1-ю чашку приходится много материала и соответственно много микробов, на 2-ю меньше и на 3-ю еще меньше.

Можно получить изолированные колонии при посеве петлей. Для этого исследуемый материал эмульгируют в бульоне или изотоническом растворе натрия хлорида.

2-й день — изучают рост микробов на чашках. В 1-й чашке обычно бывает сплошной рост — выделить изолиро­ванную колонию не удается. На поверхности агара во 2-й и 3-й чашке вырастают изолированные колонии. Их изучают невооруженным глазом, с помощью лупы, при малом увеличении микроскопа и иногда в стереоскопиче­ском микроскопе. Нужную колонию отмеча­ют со стороны дна чашки и пересевают на скошенный агар. Посевы ставят в термостат.

Пересевать можно только изолированные колонии.

3-й день — изучают характер роста на скошенном ага­ре. Делают мазок, окрашивают его, и убедившись в том, что культура чистая, приступают к ее изучению. На этом выделение чистой культуры заканчивается. Выделенная из определенного источника и изученная культура назы­вается штаммом.

При выделении чистой культуры из крови (гемокультуры) ее предварительно «подращивают» в жидкой среде: 10—15 мл стерильно взятой крови засевают в 100— 150 мл жидкой среды. Так поступают потому, что в крови обычно мало микробов. Соотношение засеваемой крови и питательной среды 1:10 не случайно — так достигается разведение крови (неразведенная кровь губительно, дей­ствует на микроорганизмы). Колбы с посевом ставят в термостат. Через сутки (иногда через большее время в зависимости от выделяемой культуры) из содержимого колб делают высевы на чашки для получения изолирован­ных колоний. При необходимости повторяют высевы с интервалами 2—3 дня.

При выделении чистой культуры из мочи, промывных вод желудка и других жидкостей их предварительно центрифугируют в асептических условиях и засевают осадок. Дальнейшее выделение чистой культуры производят обычным способом.

Для выделения чистой культуры широко применяют элективные среды.

В ряде методов для получения чистых культур используют биологические особенности выделяемого микроба. Например, при выделении спорообразующих бактерий посевы прогревают при 80°С 10 мин, убивая этим вегетативные формы; при выделении возбудителя туберкулеза, устойчивого к кислотам и щелочам, с помощью этих веществ посевной материал освобождают от сопутствующей флоры; для выделения пневмококка и палочки чумы исследуемый материал вводят белым мышам — в их организме, высокочувствительном к данным возбудителям, эти микробы размножаются быстрее других (см. с. 255, 334, 383).

В научно-исследовательской работе, особенно при генетических исследованиях, необходимо получать культуры заведомо из одной клетки. Такая культура называется клон. Для ее получения чаще всего пользуются микроманипулятором — прибором, снабженным инструментами (иглами, пипетками) микроскопических размеров. С помощью держателя под контролем микроскопа их вводят в препарат «висячая капля», извлекают нужную клетку (одну) и переносят ее в питательную среду.