Метод Къельдаля (арбитражный)

Предназначен для определения содержания белка в блюде или рационе с целью контроля его энергетической ценности. Сущность метода состоит в разрушении органического вещества навески концентрированной серной кислотой в присутствии катализаторов (сульфата меди (II) и сульфата натрия). Выделившийся в результате реакции азот улавливается серной кислотой и образуется сульфат аммония, при добавлении едкого натра выделяется аммиак, который отгоняют в раствор серной кислоты и оттитровывают. Для пересчета на содержание белка количество азота, содержащегося в навеске, умножают не соответствующий коэффициент. Коэффициенты пересчета выведены на основании процентного содержания азота в отдельных видах продуктов.

Аппаратура, материалы, реактивы. Весы лабораторные; плитка электрическая или газовые горелки; сетка асбестовая; колбы Къельдаля вместимостью 100, 200 см³ с грушевидной стеклянной пробкой; цилиндры измерительные вместимостью 10,25,50,100,200,250 см³; штатив; колба плоскодонная вместимостью 500 см³ и 1 дм³; колба мерная вместимость 1 дм³; каплеуловитель стеклянный лабораторный; холодильник стеклянный лабораторный; трубки резиновые; пробки резиновые; трубка стеклянная; капельница стеклянная лабораторная; воронка стеклянная диаметром 5-7 см; наконечник стеклянный; бюретка вместимостью 25 см³; колба коническая вместимостью 200 см³; фольга алюминиевая; бумага лакмусовая (красная и синяя); фильтры обеззоленные; палочка стеклянная; серная кислота плотностью 1,84 г/см³; сульфат меди (II); сульфат натрия; гидроксид натрия, раствор с массовой долей 33%; фиксанал серной кислоты. 0,05 моль/дм³ (0,1н) раствор; фиксанал гидроксида натрия, 0,1 моль/дм (0,1 н) раствор (поправочный коэффициент устанавливают по 0,05 моль/дм³ (0,1н) раствору серной кислоты); фенолфталеин, спиртовой раствор с массовой долей 1%; спирт этиловый; вода дистиллированная; метиленовый голубой, водный раствор с массовой долей 0,1% (раствор 1); метиловый красный, спиртовой раствор с массовой долей 0,02% (раствор 2); смешанный индикатор (к 25 см³ раствора метиленового голубого с массовой долей 0,1% добавляют 3 см³ спиртового раствора метилового красного с массовой долей 0,02%); лакмусовая бумага.

Проведение испытания. На взвешенный обезволенный фильтр размером 3×3 см берут навеску с точностью 0,001 г с таким расчетом, чтобы в пробе содержалось примерно 20-25 мг азота (для продуктов животного происхождения – 0,5-1,0 г, для продуктов растительного происхождения, за исключением блюд из бобовых – свыше 1 г). Очень влажные навески взвешивают в лодочке из фольги или в обрезанной пробирке. Навеску вместе с фильтровальной бумагой, фольгой или пробиркой помещают в колбу Къельдаля вместимостью 100 см³.

При помощи измерительного цилиндра в колбу приливают (соответственно взятой навеске) 10-20 см³ концентрированной серной кислоты плотностью 1,84 г/см³. Туда же вводят катализаторы: 0,5 г сульфата меди (II) и 7,5 г сульфата натрия. Колбу устанавливают в наклонном положении в вытяжном шкафу с помощью железного штатива на электрическую плитку с асбестовой сеткой и приливают 1 см³ этилового спирта во избежание выбрасывания жидкости. Колбу закрывают специальной стеклянной пробкой, вначале осторожно подогревают и производят сжигание в течение 4-8 ч в зависимости от состава исследуемого блюда. При вспенивании колбу снимают с огня и слегка встряхивают для разрушения пены. Сжигание можно считать законченным, когда содержимое колбы станет прозрачным, бесцветным или слегка зеленоватым.

Далее собирают прибор для отгона аммиака. Плоскодонную колбу с помощью резиновой пробки соединяют через насадку-каплеуловитель с концом шарикового холодильника; холодильник закрепляют на штатив и подводят к нему воду. В эту же пробку вставляют стеклянную трубку на которую надевают резиновую трубку с зажимом[10]. К нижнему концу холодильника через резиновую трубку присоединяют стеклянный наконечник. Наконечник опускают в коническую колбу вместимостью 250 см³, куда предварительно приливают 40 см³ 0,05 моль/дм³ (0,1 н) раствора серной кислоты для улавливания аммиака. Наконечник погружают на 1,5-2 см в раствор серной кислоты[11], проверяют герметичность соединений.

Содержимое колбы Къельдаля слегка охлаждают[12], в колбу приливают осторожно по стенке около 50 см³ дистиллированной воды, жидкость перемешивают круговыми движениями и переливают в плоскодонную колбу вместимостью 0,5-1 дм³. Колбу Къельдаля несколько раз ополаскивают дистиллированной водой, промывные воды переносят в ту же плоскодонную колбу. Всего на перенесение навески используют 150-200 см³ дистиллированной воды.

В плоскодонную колбу, куда помещен раствор, опускают красную лакмусовую бумагу и вливают раствор гидроксида натрия с массовой долей 33% при помощи воронки, вставленной в приспособление для вливания щелочи, из расчета 40 см³ на каждые 10 см³ серной кислоты, взятой для сжигания навески. Вливание раствора щелочи производят до тех пор, пока лакмусовая бумага не станет отчетливо синего цвета. Вливание щелочи следует производить очень осторожно, чтобы не произошло выбрасывания содержимого колбы.

После вливания раствора щелочи систему для отгонки плотно присоединяют к колбе и еще раз проверяют на герметичность. Содержимое плоскодонной колбы перемешивают круговыми движениями. Колбу укрепляют на штативе, помещают под нее электрическую плитку пли газовую горелку с асбестовой сеткой, включают воду и производят отгонку аммиака при постоянном кипении содержимого колбы. Скончание выделения аммиака устанавливают по исчезновению щелочной реакции отгонной жидкости по красной лакмусовой бумаге. После отгонки наконечник промывают дистиллированной водой для того, чтобы смыть серную кислоту. Приемную колбу снимают и содержимое титруют 0,1 моль/дм³ раствором гидроксида натрия, добавив 3-5 капель раствора фенолфталеина или смешанного индикатора. Титрование ведут до перехода бесцветного раствора в слабо-розовый (при использовании фенолфталеина) фиолетового в зеленый (при смешанном индикаторе). Параллельно проводят контрольный опыт, оттитровывая 40 см³ 0,05 моль/дм серной кислоты 0,1 моль/дм³ щелочью.

Обработка результатов. Содержание азота в граммах рассчитывают по формуле

Х = , (53)

где 0,0014 - количество азота в граммах, соответствующее 1 см 0,05 моль/дм³ раствор серной кислоты;

V - количество кубических сантиметров 0,1 моль/дм³ раствора щелочи, пошедшее на титрование 0,05 моль/дм³ раствора серной кислоты в контрольном опыте, см³;

V₁ - количество кубических сантиметров 0,1 моль/дм раствора щелочи, пошедшее на титрование С,05 моль/дм" раствора свободной серной кислоты в рабочем опыте, см³;

К - поправочный коэффициент к 0,1 моль/дм³ раствору щелочи;

m - масса навески;

Р - масса исследуемого блюда (рациона), г.

Для определения содержания белка в блюде полученное количество азота в граммах умножают на соответствующий коэффициент. В среднем коэффициент пересчета азота на содержание белка в животных пищевых продуктах равен 6,25 в растительных продуктах – 5,5 - 6.

О принятом коэффициенте должно быть указано в рабочем журнале и в бланке результатов анализа.

Пример расчета. В приемную колбу взято 30 см³ точно 0,05 моль/дм³ раствора серной кислоты. На титрование избытка серной кислоты пошло и 21,56 см³ точно 0,1 моль/дм³ раствора едкого натра. Навеска второго блюда, взятая для анализа, составляет 0,5 г. Масса блюда 250 г.

Количество азота в блюде в граммах

X = = 6,75 г

Количество белке в блюде: 6,75 – 6,25 = 42,18 г

Фотометрический метод

Метод основан на минерализации пробы по Къельдалю и фотометрическом измерении интенсивности окраски индофенолового синего, которая пропорциональна количеству аммиака в минерализате.

Аппаратура, материалы, реактивы. Весы лабораторные; спектрофотометр или фотоэлектроколориметр, обеспечивающий измерения в интервалах волн от 315 до 670 нм; мясорубка бытовая или электромясорубка; промывалка стеклянная лабораторная; пробирки стеклянные вместимостью 20-25 см³; колбы стеклянные вместимостью 20-25 см³, пипетки вместимостью 1 см³ и 5 см³; колбы мерные вместимостью 100, 250, 1000 см³; воронки стеклянные; бюксы; фильтры беззольные, бумажные; кислота серная, плотностью 1,84 г/см³; кислота соляная; пероксид водорода; вода дистиллированная; сульфат аммония; известь хлорная: натрия гидроксид; фенол; натрий нитропруссидный; тиосульфат натрия ; натрия гипохлорит или натрия дихлоризоцианурат, иодид калия; карбонат натрия безводный.

Подготовка к испытанию. Реактив I. 10 г фенола и 0,052 нитропрусида натрия растворяют в мерной колбе вместимостью 1000 см³ дистиллированной водой, доводят объем до метки.

Реактив 2. 5 г гидроксида натрия растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 1000 см³, после охлаждения добавляют количество исходного раствора гипохлорита натрия из расчета его содержания 0,42 г/дм³ или 0,2 г дихлоризоцианурата натрия и доводят объем колбы дистиллированной водой по метки.

Приготовленные реактивы хранят в темной посуде в холодильнике не более 2 месяцев.

Проведение испытания. Навеску продукта рассчитывают по разности для этого часть измельченной средней пробы помещают в бюксу, закрывают крышкой и взвешивают с точностью до 0,0002 г. Затем из бюксы скальпелем отбирают 0,4-0,5 г продукта на листок беззолъного фильтра и вместе с ним осторожно опускают в колбу Къельдаля. Бюксу закрывают, взвешивают и рассчитывают точную массу продукта, взятого для анализа.

Такой же листок беззолъного фильтра помещают в контрольную колбу Къельдаля. Затем в обе колбы добавляют 10 см³ концентрированной серной кислоты, 1-2 г сульфата калия и проводят минерализацию, для интенсивности процесса периодически добавляя в охлажденную пробу пероксид водорода (5-7 см³ в течение всей минерализации). Допускается применение других катализаторов, обеспечивающих точность определения.

После минерализации колбы охлаждают и содержимое количественно переносят в мерные колбы вместимостью 250 см³, после охлаждения объем доводят до метки и содержимое перемешивают.

В мерную колбу вместимостью 100 см³ переносят 5 см³ полученного минерализата и доводят до метки дистиллированной водой. Для проведения цветной реакции 1 см³ разбавленного минерализата вносят в пробирку, затем последовательно добавляют 5 см³ реактива 1 и 5 см³ реактива 2, перемешивают содержимое пробирки. Через 30 мин определяют оптическую плотность растворов на спектрофотометре при длине волны 625 нм или фотоэлектроколориметре.

Контрольный раствор готовят одновременно, используя для этой цели контрольный минерализат.

Стабильность окраски растворов сохраняется в течение одного чеса. Температура реактивов при проведении цветной реакции должна быть не ниже 20°С.

По полученному значению оптической плотности с помощью калибровочного графика находят концентрацию азота.

Обработка результатов. Массовую долю белка (X), в процентах вычисляют по формуле

X = , (54)

где С - концентрация азота, найденная по калибровочному графику в соответствии с полученной оптической плотностью, мкг/см³;

m - масса навески пробы, г ;

250 - объем минерализата после первого разведения, см³;

5 - объем разбавленного минерализата для вторичного разведения, см ;

100 - объем минерализата после вторичного разведения, см³;

I - объем раствора, взятый для проведения цветной реакции, см³;

10⁶ - множитель для перевода г в мкг;

100 - множитель для перевода в проценты;

6,25- коэффициент пересчета на белок.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений.

Расхождение между параллельными определениями не должно превышать 0,1% по содержанию азота для мяса и мясопродуктов.