Бакмиды принцип конструирования и использования

Билет 1

Характеристика агробактерий

Бактерии рода Agrobacterium, вызывающие заболевания растений из класса Двудольные.

Фитопатогены:

- Agrobacterium tumefaciens – корончатый галл (утолщение стебля в районе корневой шейки);

- Agrobacterium rhizogenes – бородатый корень (утолщение главного корня стержневой системы и образование на нем множества недоразвитых боковых корней);

- Agrobacterium rubi – стеблевой галл (утолщения на боковых побегах).

Сапротроф:

- Agrobacterium radiobacter.

грамотрицательные палочки 1-3 мкм длиной и 0,6-1 мкм шириной, имеют 2-6 жгутиков, расположенных перетрихиально. Аэробы, могут образовывать небольшую капсулу. Местом обитания для патогенных видов являются индуцируемые ими галлы на растениях класса Двудольные, но при отсутствии растения-хозяина эти бактерии способны сохранять жизнеспособность на растительных остатках в почве в течение нескольких лет. Большинство штаммов прототрофны, хорошо культивируются на минимальных питательных средах с сахарами в качестве источника углерода, но для некоторых природных штаммов факторами роста являются витамины, в частности пантотеновая и никотиновая кислоты.

Отличительной чертой являются: 1)отсутствие выраженной хозяйской специфичности. 2)отсутствие у них факторов патогенности повреждающего действия. Эти бактерии не выделяют в окружающую среду пекто- и целлюлолитические ферменты, способные эффективно разрушать клеточные стенки растительных клеток. 3)Входными воротами могут служить только травматические повреждения растительных тканей.

Искусственные дрожжевые хромосомы ( YAC ) Saccharomyces cerevisiae

Используется для вставок больших фрагментов (более 100 т.п.н.) ДНК. Они широко применяются для физического картирования ДНК высших эукариот, включая человека. В упрощенном виде плазмида для получения искусственных дрожжевых хромосом (pYAC) представляет собой: 1) фрагмент pBR322 (Ampr, oriE); последовательность, обеспечивающую автономную репликацию линейных молекул в клетках дрожжей (ARS); 2) последовательность, соответствующую центромерной области дрожжевой хромосомы (CEN); 3) гены биосинтеза аминокислот и азотистых оснований в дрожжевых клетках (TRP1 и URA3); 4) две теломерные области дрожжевой хромосомы (Т); 5) уникальный сайт рестрикции (например, для SmaI) и 2) два тоже уникальных (сайта рестрикции для другой рестриктазы, (BamHI-сайты). 

ДНК такой плазмиды, выделенная из E.coli, подвергается обработке двумя рестриктазами и щелочной фосфатазой (последнее необходимо, чтобы не образовывались вновь кольцевые молекулы – щелочная фосфатаза отщепляет фосфатные группы с 5’-концов, а без них ДНК-лигаза не соединяет молекулы). ДНК организма, последовательности которого хотят клонировать в дрожжах, обрабатывают рестриктазой, для которой в pYAC имелся только один уникальный сайт, и смешивают с фрагментами плазмиды. В результате лигирования получаются линейные молекулы с теломерными последовательностями по концам, которые после введения в клетки дрожжей, дефектных по тем генам синтеза аминокислот и оснований, которые имеются в плазмиде, поддерживаются как автономные хромосомы.

 Для подтверждения наличия вставки часто используют какой-либо маркерный ген, продукт которого дает цветную реакцию. В этом случае такой ген располагается так, чтобы вставка по уникальному сайту нарушала его рамку считывания, и на специальной среде отбираются неокрашенные колонии. 

Билет 2

Виргены

Расположенные в консервативной области D гены определяют способность бактериальных клеток вступать в контакт с растительными клетками и обеспечивать передачу Т-ДНК из бактериальной клетки в растительную.

Обязательными для инфицирования растения являются продукты 21 vir-гена. Эти гены образуют несколько оперонов, активирующихся при контакте с раневой поверхностью растения. Совокупность этих генов рассматривают как регулон. Активность генов vir-регулона регулируется двухкомпонентной сенсорной системой.VirA является сенсорный белком двухкомпонентной системы и представояет собой трансмембранную гистидиновую киназу.

Состоит из двух одинаковых субъединиц. Начиная от NH2-конца, в каждой субъединице имеется цитоплазматический домен, затем короткий трансмембранный участок, периплазматический домен, второй трансмембранный участок и далее три расположенных в цитоплазме домена: линкерный домен, киназный домен и ресиверный домен. В пределах киназного домена в положении 474 имеется остаток гистидина, который фосфорилируется при взаимодействии с молекулами АТФ.Ресиверный домен в отсутствии индукторов закрывает эту часть киназного домена, но при их наличии она становится доступной для белка VirG. Фосфорилированный VirG-белок активирует транскрипцию пяти vir-оперонов – virВ, virС, virD, virE, virH и трех vir-генов – virА, virG и virF.для этого в промоторах этих генов и оперонов есть вир-боксы(последовательность из 12 нуклеотидов,к которому присоединяется вирG-белок в димерном состоянии.

Бакмиды принцип конструирования и использования

включение чужеродного фрагмента в ДНК бакуловируса осуществлялось в клетках насекомого, что затрудняло контроль за этим процессом. Поэтому была разработана система, обеспечивающая осуществление всех рекомбинационных событий в клетках E.coli. Для этого была создана специальная конструкция, включающая: 1) 5’-конец гена полиэдрина; 2) ген LacZ E.coli, 3) ген устойчивости к канамицину; 4) oriV для клеток E.coli; 5) 3’-конец гена полиэдрина.

В клетках насекомого было осуществлено образование рекомбинантной ДНК, включающей такую конструкцию и весь геном бакуловируса AcMNPV и затем, после выделения такой ДНК и трансформации клеток E.coli, получена так называемая бакмида.

Для вставки в состав бакмиды гена для экспрессии используется две вспомогательных плазмиды. Первая, несущая ген устойчивости к ампициллину, имеет в своем составе: 1) правый фрагмент последовательности(attR); 2) ген устойчивости к гентамицину (Gmr); 3) промотор гена полиэдрина (p); 4) полилинкер; 5) сайт терминации-полиаденилирования гена полиэдрина (t); 6) левый фрагмент последовательност (attL). Вторая плазмида, несущая ген устойчивости к тетрациклину, имеет в своем составе гены, продукты которых обеспечивают транспозицию.

Для получения пригодной для экспрессии в клетках насекомого нужного гена конструкции этот ген вставляют по уникальному сайту рестрикции полилинкера несущей ген ампициллинрезистентности плазмиды. Затем ДНК такой «нагруженной» плазмиды смешивают с ДНК плазмиды, несущей ген тетрациклинрезистентности и гены транспозиции, и этой смесью трансформируют штамм E.coli, в клетках которого находится бакмида. Высев после трансформации на среду с канамицином, гентамицином позволяет отобрать клоны с «нагруженной нужным геном» бакмидой. Из-за разрыва последовательности гена lacZ сформированные такими клонами колонии имеют белую окраску. Клетки таких клонов проверяются на ампициллин- и тетрациклин устойчивость и для дальнейшей работы оставляются чувствительные к этим антибиотикам, но устойчивые к гентамицину варианты. После размножения таких клонов в присутствии канамицина и гентамицина из их клеток выделяют ДНК, которой и трансфецируют клетки насекомого. В последних транскрипции подвергается только та часть чужеродного фрагмента, которая включает вводимый для экспрессии ген.

Билет 3

3.1Молекулярные механизмы, обеспечивающие введение Т-ДНК в растительную клетку.Перенос Т-ДНК в растительную клетку осуществляется продуктами плазмидных vir-генов. Для формирования канала, пронизывающего оболочку бактериальной клетки, и так называемого Т-пилюса, продлевающего этот канал непосредственно до цитоплазмы растительной клетки, необходимы VirВ-белки.

Сначала с помощью белка VirВ8 белок VirВ1выводится через цитоплазматическую мембрану в периплазматическое пространство и начинает перестройку пептидогликанового слоя в данном месте. Затем белки VirВ4, VirВ10 и VirВ11 встраиваются во внутреннюю мембрану рядом с белком VirВ8, что способствует выходу в периплазму гетеродимера из белков VirВ7-VirВ9 и дальнейшему расщеплению пептидогликана.От белка VirВ1 отщепляется фрагмент VirВ1*, который закрепляется в наружной мембране, определяя место формированияТ-пилюса. Гетеродимеры VirВ7-VirВ9, благодаря наличию в белке VirВ7 липидного компонента, закрепляются в наружной мембране таким образом, чтобы белок VirВ9 был направлен в периплазматическое пространство. Белки VirВ3 и VirВ5 также связываются с наружной мембраной в месте закрепления VirВ7 и создают условия для сборки циклических олигомеров из белка VirВ2 и формирования из них Т-пилюса. Во внутреннюю мембрану дополнительно встраиваются VirВ6 и VirD4, а новые молекулы VirВ9 связываются между собой и с молекулами VirВ11 так, чтобы образовался сплошной канал, соединяющий внутреннюю и наружную мембраны. Продолжением этого канала является полый Т-пилюс, пронзающий в конечном итоге цитоплазматическую мембрану растительной клетки. Тем самым формируется путь, соединяющий цитоплазмы двух клеток и позволяющий в один этап транслоцировать из бактериальной клетки в растительную субстраты системы секреции типа IV (T4SS) - белки и нуклеопротеины.

VirВ4, VirВ11 и VirD4 могут потенциально снабжать энергией процесс сборки секреции и сам процесс секреции.

Параллельно в клетках осуществляется процессинг Т-ДНК. Суть: формирование Т-комплекса. С Т-ДНК Тi-плазмид взаимодействуют белки VirС1, VirD1(нужны для прикрепления VirD2 к концевым повторам Т-ДНК) и VirD2(основной).

Эндонуклеаза VirD2 делает надрез одной нити ДНК и начинается остоединение этой нити от комплементарной ей в направлении левого концевого повтора. Одновременно заполняются образующейся в Т-ДНК бреши новыми нуклеотидами. Отделившейся нить с VirD2-белком на 5’-конце представляет собой Т-комплекс,который направляется к секреторному каналу системы секреции типа 4.

Из-за VirD4 Т-комплекс поступает в канал системы секреции типа 4 и транспортируется в цитоплазму растительной клетки. Так же переносятся белки VirE2,VirE3,VirF.VirЕ3-считается вспомогательным белком. Молекулы VirЕ2 присоединяются к Т-комплексу по всей длине,защищая однонитевую ДНК от расщепления растительными эндонуклеазами и совместно с VirD2 определяют транспорт Т-комплекса в ядро. Далее VirЕ2 связывается с двумя растительными белками VIP1 и VIP2. Эти белки определяют перемещение Т-комплекса из цитоплазмы в нуклеоплазму. Далее VirD2 и VirЕ2 участвуют в процессе интеграции Т-ДНК в хромосомную ДНК растения.