Вирусы растений для создания векторных систем

Наиболее пригодными яаляется Caulimoviridae - каулимовирусы.(их генома, представляет собой двунитевую ДНК до 8300 п.н.). Их ДНК имеет вид кольцевой ковалентко замкнутой суперскрученной молекулы. Эта ДНК транскрипционно активна и основными транскриптами являются 35S и 19S РНК. 35S РНК соответствует по длине всему геному вируса и служит матрицей для синтеза ДНК, которая может упаковываться в вирусные капсиды. Наличие в геноме вирусов гена обратной транскриптазы и этапа обратной транскрипции в жизненном цикле сближает каулимовирусы с ретровирусами животных, из-за чего их объединяют в супергруппу параретровирусов.

Сейчас известно более десятка каулимовирусов. Наиболее изученным вирус мозаики цветной капусты.

Успешными примерами экспрессии чужеродных для растений генов с вирусных векторов на основе каулимовирусов были:

- бактериальный ген дигидрофолатредуктазы =>(введенный в) турнепс;

- ген человеческого α-интерферона.

- ген неомицинфосфотрансферазы I (бактериальный транспозон Tn 903) => табак;

- гена хлорамфениколацетилтрансферазы (бактериальный транспозон Tn 9) => табак;

- ген металлотионеина млекопитающих;

С помощью таких векторов можно вводить в растения только небольшие фрагменты (не более 300 п.н.), и что полученные путем вирусной трансформации растения не способны передавать приобретенный признак в рядах поколений.

Можно прочитать еще про вирус мозаики цветной капусты..минимально..это билет 9, 1 вопрос.

Билет 9

Генет.инженерия вируса мозаики цветной капусты

Наиболее изученным вирусом является вирус мозаики цветной капусты.В вирусных частицах ДНК CaMV представляет собой кольцевую, но не ковалентно замкнутую молекулу.

 В ее составе имеются 7 открытых рамок считывания. Рамка I несет информацию о белке, обеспечивающем перенос вирусных частиц по плазмадесмам из одной растительной клетки в другую, то есть системное распространение по растению. Рамки II и III кодируют протеины Р2 и Р3, которые отвечают за перенос вирионов тлями от растения к растению и называются факторами трансмиссии. Рамка IV соответствует предшественнику капсидных белков, рамка V – предшественнику протеиназы, обратной транскриптазы и РНКазы Н, которые нужны для построения ДНК на матрице 35S РНК. Рамка VI кодирует белок телец включения, которые появляются в цитоплазме инфицированной растительной клетки и служат местом синтеза геномной ДНК и сборки вирусных частиц. Для белка, кодируемого рамкой VII функции не известна.С точки зрения генетической инженерии особый интерес представляют две межгеномные области , в которых находятся промоторы 19S РНК и 35S РНК. Именно в эти области осуществляли вставки фрагментов ДНК с целью оценки возможностей использования каулимовирусов как векторных молекул для генетической трансформации растений. Помимо межгеномных областей пригодными для инсерций генетического материала без последующего нарушения цикла репродукции вируса являются рамки считывания II и III.

Получение и применение трансгенных овец

Нужно для использования их молока для получения медицинских препаратов, поскольку генетические конструкции для экспрессии генов человека в клетках молочной железы этих животных получены и апробированы.  В гибридных ДНК используются промоторы гена бетта-лактоглобулина, гена бетта-казеина и гена альфа S1-казеина, а среди клонированных генов человека – ген активатора плазминогена, ген альфа-антитрипсина (при отсутствии этого белка развивается эмфизема, дефицит ингибитора сывороточных протеаз, поражение легких, цирроз печени), ген фактора IX системы свертывания крови (белок нужен для лечения гемофилии В), ген лактоферрина, ген интерлейкина-2. Из трансгенного мелкого рогатого скота упоминают только овец с повышенной скоростью роста шерсти. Этот вариант был получен путем введения кДНК гена инсулиноподобного фактора роста 1 овцы под промотором гена кератина мыши.

Билет 10

Получение и направление их использования трансгенных коз. ( вроде так)

Нужно для использования их молока для получения медицинских препаратов, поскольку генетические конструкции для экспрессии генов человека в клетках молочной железы этих животных получены и апробированы. В гибридных ДНК используются промоторы гена бетта-лактоглобулина, гена бетта-казеина и гена альфа S1-казеина, а среди клонированных генов человека – ген активатора плазминогена, ген альфа-антитрипсина (при отсутствии этого белка развивается эмфизема, дефицит ингибитора сывороточных протеаз, поражение легких, цирроз печени), ген фактора IX системы свертывания крови (белок нужен для лечения гемофилии В), ген лактоферрина, ген интерлейкина-2. Из трансгенного мелкого рогатого скота упоминают только овец с повышенной скоростью роста шерсти. Этот вариант был получен путем введения кДНК гена инсулиноподобного фактора роста 1 овцы под промотором гена кератина мыши.

Методы введения генетической информации в растения с помощью агробактерий (трансформация изолированных растительных клеток, кокультивация, слияние бактериальных сферопластов и протопластов растительных клеток).

Кокультивация - для получения трансгенных двудольных растений. Для исходного материала нужно иметь штамм агробактерии с векторной конструкцией. Вектор должен содержать последовательность гена, который нужно ввести в геном растения.

В качестве эксплантов для трансформации берут стерильные листовые диски. Экспланты инокулируют жидкой средой. В этой среде находится агробактерия с векторной конструкцией. Происходит заражение клеток раневой поверхности экспланта и после 24-48 ч. культивирования происходит встраивание в растительный геном фрагмента т-ДНК с чужеродным геном. Затем экспланты переносят в стерильную воду и затем подсушивают на поверхности стерильной фильтровальной бумаги (удаление агробактерий). Далее экспланты переносят в жидкую каллусиндуцирующую среду с канамицином и антибиотиком, к которому чувствительны агробактерии (например, ампициллином), и культивируют. После отмывания экспланты переносят на агаризованную каллусиндуцирующую среду с обоими антибиотиками (канамицин + ампициллин) и продолжают культивирование до формирования хорошо выраженных каллусов.

Метод слияния протопластов растительных клеток и сферопластов бактерий. Бактериальные клетки лешенные твердой клеточной стенки называют сферопластами,потому что еще нет способа полного удаления клеточной стенки бактерий. Такие клетки имеют сферическую форму, могут сливаться друг с другом или с протопластами других клеток в растворах веществ, которые способствуют объединению биологических мембран – полиэтиленгликоля, поливиниловый спирта или других. Для реализации такого метода нужно получение сферопластов из бактериальной культуры несущей соответствующую генетическую конструкцию. Штаммы Е.coli можно превратить в сферопласты и их можно использовать для слияния с протопластами растительных клеток.

Трансформация изолированных клеток. Экспременты по введению ДНК в целое растение давали низкую частоту образования трансформантов. Поэтому начали использовать изолированные лишенные клеточной стенки клетки.

Для удаления клеточной стенки растительных клеток используют комплекс ферментов, состоящий из пектинлиаз и целлюлаз. Полученные протопласты трансформируются при обработке их растворами ДНК. Если повысить значение рН растворов до 10 и если в трансформирующих растворах будут находиться дивалентные ионы (Са2+, Mg2+, Zn2+ и Cu2+), то это повысит частоту трансформации.

Билет 11