Бакуловирусы насекомых как основа векторных сиситем

Механизм их репродукции в организмах членистоногих: После попадания вириона бакуловирусов в клетку эпителия кишечника насекомого он проникает в ядро, где и происходит освобождение двунитевой ДНК из белкового капсида. В ядре происходит репликация этой ДНК, затем экспрессия генов и образование новых вирусных частиц. Образовавшиеся вирионы отшнуровываются от клеток и гемолимфой насекомого разносится по организму животного, но большая часть собирается в компактную структуру внутри клетки и покрывается специальной оболочкой, состоящей в основном из белка полиэдрина,т.е. переходит в неактивное состояние.

Если удалить белок полиэдрин, то репродукция вирусных ДНК продолжится в обычном порядке. Так же выяснили,что промотор гена полиэдрина является очень сильными работает конститутивно.  Это и стало основой для применения бакуловирусов в качестве векторных систем.

Основным видом вируса, на котором проводятся все исследования генно-инженерного направления, является вирус множественного ядерного полиэдроза (аутографа калифорника). Векторы для введения генетической информации в клетки насекомых представляют собой стандартную плазмиду E.coli на основе pBR322 в которую встроены фрагменты ДНК AcMNPV:

1) последовательность, предшествующая 5’-концу гена полиэдрина 

2) промоторная область этого же гена, обозначаемая Рр;

3) сайт терминации транскрипции и полиаденилирования гена полиэдрина (Pt).

Между Рр и Рt находится один из стандартных искусственных полилинкеров.

(это принип введения чужеродной генетической инормации с помощью бакуловирусов, 15 билет 2 вопрос…прочитаешь,если будет время)

 Последовательность нужного гена вводится в вектор в системе E.coli и здесь же нарабатывается ДНК для трансфекции. Трансфекции подвергаются клетки насекомого, уже несущие AcMNPV, и если происходит двойной кроссинговер, то в ДНК вируса исходный ген полиэдрина заменяется чужеродным геном. Было установлено, что линеаризованная ДНК вируса гораздо хуже вызывает инфекционный процесс. Это послужило основой для улучшения системы бакуловирусных векторов.

В геном AcMNPV ввели уникальный сайт для рестриктазы Bsu36I и в клетки насекомых вводили вирусную ДНК после ее обработки этой рестриктазой. Репродукция вируса происходила только лишь в некоторых клетках. Но если вместе с линеаризованной ДНК вируса вводить кольцевую ДНК вектора, в которой есть сайты для гомологичной рекомбинации с ДНК вируса что, приводит к репродукции вируса. Эта система была улучшена за счет введения еще одного сайта для рестриктазы Bsu36I в один из генов, ответственных за репликацию ДНК вируса. Причем оба сайта для Bsu36I локализовались слева и справа от структурного гена полиэдрина в результате чего обработка этой рестриктазой приводила к полному удалению из ДНК вируса последовательности гена полиэдрина.

Получение трансгенных растений, устойчивых к насекомым-вредителям

Бактерии вида Bacillus thuringiensis могут вызывать гибель различных видов насекомых. Эти бактерии накапливают в цитоплазме белок протоксин, которые под действием протеаз пищеварительного сока насекомых превращаются в активный токсин. (проверялся на белых мышах, 15 дней кормили пищей с 5 г энтомотоксина..через 10 минут польностью переваривается)

Гены, ответственные за синтез инсектицидных белков В. thuringiensis практически не экспрессируются в растениях. НО эти белки нужны в большом количестве. Для этого уменьшили размер встроенного гена так, чтобы синтезировалась только N-концевая часть молекулы токсина. Для повышения уровня экспрессии ген снабдили сильным растительным промотором. Количество синтезируемого токсина увеличилось, и трансгенные растения получили некоторую защиту от насекомых-вредителей.

Для повышения инсектицидного качетсва трансгенных растений модифицировали последовательности укороченных генов энтомотоксинов (cry-генов). В них заменили кодоны, способствующие образованию вторичной структуры РНК и участки, способные приводить в появлению сайтов полиаденилирования. Клетки растений с таким геном продуцировали в 100 раз больше токсинов, чем у растений с геном дикого типа.

Недостаток таких растений заключается в появлении устойчивых к данному таксону вредителей. Это можно решить, если экспрессия гена энтомотоксина будет осуществляться с регулируемых промоторов. Токсин будт образовываться на определенном этапе вегетации. На табаке были опробованы конструкции с промоторами генов PR-белков,экспрессию их вызывают опрыскиванием нетоксичными химикатами. Одноразовое применения такого препарата приводит к накоплению токсина в растении, а затем он постепенно разрушается.

Для непещевых и некормовых растений используют холестеролоксидазу. Она токсична против личинок жесткокрылых. Ее испытали на табаке и затем ввели в хлопчатник для защиты от хлопкового долгоносика.

Билет 13