Характеристика ti плазмид октопинового типа

Т-ДНК имеет концевые прямымые повторы длиной 25 пар нуклеотидов, между которыми располагаются гены, не способные транскрибироваться в прокариотической клетке. Отличительной чертой октопиновых плпзмид Т-ДНК является наличие внутри Т-ДНК еще двух таких же повторов, что приводит к разделению Т-ДНК на ТL-ДНК (левая Т-ДНК) и ТR-ДНК (правая Т-ДНК). Может переноситься и интегрироваться в растительный геном и как единая последовательность и как два отдельных фрагмента.

В левой части Т-ДНК Ti-плазмид находятся гены, определяющие способность опухолевых клеток к интенсивному делению. В плазмидах октопинового типа это два гена iaaM и iaaH, продукты которых катализируют превращение триптофана сначала в индолацетамид, а затем в индолилуксусную кислоту

 В конце левой части октопиновых плазмид расположены два Гена(Ген ocs кодирует октопинсинтазу и ген ons, продукт которого обеспечивает выделение синтезируемых опинов из опухолевых клеток в межклеточное пространство). Остальные гены синтеза опинов mas1, mas2 и ags - расположены в правой Т-ДНК октопиновых плазмид.

Во всех Ti-плазмид обязательным является участок, обеспечивающий репликацию плазмиды (точка ori или oriV).а так же в плазмиде находятся гены tra-оперона. Гены этого оперона кодируют белки, определяющие способность агробактериальной клетки передавать копии плазмидной ДНК другим бактериальным клеткам при конъюгации.есть участок ape , от наличия которого зависит устойчивость бактериальных клеток к бактериофагу Ар1.

Характеристика дрожжей как объекта ген инж

 Некоторые из ферментных систем дрожжей достаточно сходны с таковыми животных, это дает преимущества дрожжевых клеток перед бактериальными в технологиях микробного производства белков высших организмов.

Дрожжи при определенных условиях могут эффективно воспринимают экзогенные молекулы ДНК, несмотря на наличие ригидной клеточной стенки. В настоящее время разработаны методы получения и регенерации дрожжевых протопластов, их трансформация похожа на стандартные методы трансформации бактерий. Возможно введение ДНК в дрожжевые клетки при использовании ацетата лития, также применяется электропарация. Самыми изученными являются пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae(имеют хромосомную и плазмидную ДНК).Обладают системами секреции белковых молекул(как у эукариот ,осуществляется посттрансляционная перестройка белка-важно для генной инженерии.Три подхода введения чужеродной ДНК:1.Система автономной репликации природных дрожжевых плазмид(2 мкм плазмиды) включает компоненты сайты начала репликации в прокариотических клетках (oriV из pBR322), сайт инициации репликации в клетках дрожжей и селективный маркер для отбора трансформированных дрожжевых клеток. В качестве такого маркера, как правило, служит какой-либо дрожжевой ген биосинтеза той или иной аминокислоты (лейцина, гистидина, триптофана) или азотистого основания (урацила). Естественно, что в этом случае в качестве трансформируемых дрожжевых культур используют соответствующего мутанта, дефектного по такому же гену. Оба эти компонента вектора присутствуют во фрагменте 2- мкм плазмиды дрожжей, лигированном с плазмидой pBR322. Селективным маркером для поддержания вектора в бактериальных клетках является ген ампициллинрезистентности из pBR322. (челночный вектор)2. интегрирующие векторы. Отличие таких молекул заключается в том, что в их состав вводятся последовательности какого-либо известного хромосомного гена либо как единый фрагмент, либо в виде двух фрагментов, окаймляющих предназначенную для введения в геном последовательность. В качестве примеров таких векторов наиболее часто упоминают конструкции, разработанные для другого вида дрожжей – Pichia pastoris. 3.«искусственная дрожжевая хромосома» (YAC). Этот вариант векторных молекул разработан для Saccharomyces cerevisiae и используется для вставок больших фрагментов (более 100 т.п.н.)

Билет 6

Афинные метки.

Одной из проблем при работе с клетками животных как системами для продукции чужеродных белков является выделение гетерологичного белка в чистом виде. На модели культур клеток насекомых и были отработаны подходы для улучшения очистки таких белков. Для этого использовались кодирующие короткие специфические аминокислотные последовальности фрагменты ДНК, являющиеся основой для аффинного связывания при хроматографии на колонках. Один из вариантов – это применение фрагмента, кодирующего гексагистидин (обозначается His 6 ). Эта последовательность помещается сразу же за промотором, вплотную к ней располагается так называемый спейсерный участок, кодирующий 7-10 любых аминокислот, и далее следует последовательность, кодирующая шесть аминокислот, распознаваемых специфической протеазой.

Имеющий такую «надстройку» продуцируемый клетками насекомых гетерологичный белок при пропускании белковой фракции гомогената клеток через колонку с никель-агарозой задерживается на сорбенте. Элюцию белка осуществляют промыванием колонки раствором имидазола - вытесняет гексагистидин из сайтов связывания на агарозе.

Полученный чистый белок обрабатывают протеазой, отщепляющей афинную метку. Если аффинная метка не вляет на функцию белка, то обработку протеазой можно не делать.

Это схему используют для выделения гетерологического белка из любых трансгенных кл.

Афинными метками являются : последовательности, связывающиеся с глутатионом; последовательности из мальтозосвязывающего белка или последовательности, дающие эпитопы, узнаваемые паратопами конкретных моноклональных антител.

В зависимости от используемой метки подбирается сорбент в колонках и используемые для элюции растворы.