Биобаллистика как метод введения ДНК в клетки

Биобаллистика – это бомбардировка микрочастицами. В качестве микрочастиц используют сферические частицы благородных металлов – золота или вольфрама. ДНК на частицах закрепляют путем обработки растворами нуклеиновой кислоты и CaCl2, или спермидина, или полиэтиленгликоля. С помощью специальных приборов покрытые ДНК частицы разгоняют и направляют поток таких частиц на изолированные клетки, фрагменты растения или целостное растение. Для создания потока летящих с указанной скоростью частиц используют либо газы либо сжатый воздух или гелий. Частицы пробивают клеточную стенку и мембраны растительной клетки. При этом их скорость и размеры таковы, что клетки практически не повреждаются. Доставленная в клетки ДНК частично переходит в свободное состояние и может взаимодействовать с молекулами ДНК в ядре, митохондриях или пластидах, то есть такой метод введения генов может быть использован не только для введения в пластидный геном.

Метод бомбардировки микрочастицами позволяет трансформировать растения практически любых видов. Но при этом известно, что происходит она с невысокой частотой, а интеграция и экспрессия чужеродных генов может зависеть от вектора, используемого для их введения. Например, частота трансформации повышается, если используется линейная, а не кольцевая ДНК.

Билет 19

Использование липосом для введения ДНК в клетку

Липосомами называют везикулы, которые можно получить суспендируя в растворе фосфолипидные молекулы по особой методике. Если в таком растворе присутствуют молекулы ДНК или РНК, они оказываются внутри везикул. При совмещении протопластов растительных клеток и липосом в буфферных растворах, содержащих способствующие слиянию мембран и эндоцитозу вещества, высокую концентрацию ионов кальция и имеющих щелочные значения рН, происходит ассоциация липосом с поверхностью мембраны протопластов и поглощение их путем эндоцитоза.В цитоплазме протопласта фосфолипидная оболочка со временем распадается, освобождая молекулы нуклеиновой кислоты. Недостатком метода считаются высокие требования к протопластированию – протопласты не должны иметь на поверхности даже остатков клеточной стенки. Кроме того, получение липосом несколько усложняет методику в целом, но это компенсируется снятием токсического эффекта высоких концентраций ДНК и защитой ДНК от эндонуклеаз растительной клетки.

Получение трансгенных растений с улучшенными пищевыми качествами и товарным видом

Для улучшения хранения продуктов были использованы несколько подходов.

Один из них заключается в получении кДНК на матрицах зрелых иРНК этих генов и создания конструкций, дающих при экспрессии в клетках растений антисмысловую РНК.

 Следующий подход состоит в получении растений, не продуцирующих этилен. Были получены генетические конструкции, дающие при экспрессии антисмысловые РНК АСС-синтетазы и АСС-оксидазы, и их введение в растение приводило к гораздо более медленному накоплению этилена в тканях плода.

Для придания товару более сладкого вкуса использовали ген белка монеллина из плодов тропического растения. Этот белок очень не стоек термически и легко распадается. Для введения этого белка в традиционно потребляемые в сыром виде растения использовали последовательность, кодирующую обе цепи монеллина.

Основными питательными веществами для человека и животных в растительных тканях являются углеводы (крахмал, моно и дисахариды) и белки, которых крайне мало. Наиболее насыщенными белками из органов растений являют семена.

Существует несколько подходов для создания растений с улучшенным набором запасных белков:

1) Совмещение в одном растении генов запасных белков из генов различных других растений. Например: ген фазеолин был введён в клетки табака.

2) Это использование собственных генов тех или иных растений, поставленные под более сильный промотор.

3) Направленное изменение аминокислотного состава определённых запасных белков, посредством введения в исходную последовательность кодонов, соответствующих незаменимым аминокислотам. Наиболее лучшим местом для введения является С-концевой домен, у которого имеется гипервариабельный участок.

Ещё одним подходом для улучшения аминокислотного состава запасных белков семян является изменение общего количества аминокислот, синтезируемых в растениях.

Примером получения с/х растения является «золотой рис». Золотой – т.к. имеет большое количество провитамина А. Клетки «золотого риса» были трансформированы генетической конструкцией.

Так же был получен картофель с улучшенным качеством крахмала. Путём введения гена амилозы (имеет линейные цепи), в обратной ориентации и под сильный промотор. Количество амилозы стало равно нулю, а количество амилопектина повысилось в несколько раз. Именно он указывает на качество крахмала.

Билет 20