Молекулярные механизмы транспорта Т-ДНК в клетки растений

Перенос Т-ДНК в растительную клетку осуществляется продуктами плазмидных vir-генов. Для формирования канала, пронизывающего оболочку бактериальной клетки, и так называемого Т-пилюса, продлевающего этот канал непосредственно до цитоплазмы растительной клетки, необходимы VirВ-белки.

Сначала с помощью белка VirВ8 белок VirВ1выводится через цитоплазматическую мембрану в периплазматическое пространство и начинает перестройку пептидогликанового слоя в данном месте. Затем белки VirВ4, VirВ10 и VirВ11 встраиваются во внутреннюю мембрану рядом с белком VirВ8, что способствует выходу в периплазму гетеродимера из белков VirВ7-VirВ9 и дальнейшему расщеплению пептидогликана. От белка VirВ1 отщепляется фрагмент VirВ1*, который закрепляется в наружной мембране, определяя место формирования Т-пилюса. Гетеродимеры VirВ7-VirВ9, благодаря наличию в белке VirВ7 липидного компонента, закрепляются в наружной мембране таким образом, чтобы белок VirВ9 был направлен в периплазматическое пространство. Белки VirВ3 и VirВ5 также связываются с наружной мембраной в месте закрепления VirВ7 и создают условия для сборки циклических олигомеров из белка VirВ2 и формирования из них Т-пилюса. Во внутреннюю мембрану дополнительно встраиваются VirВ6 и VirD4, а новые молекулы VirВ9 связываются между собой и с молекулами VirВ11 так, чтобы образовался сплошной канал, соединяющий внутреннюю и наружную мембраны. Продолжением этого канала является полый Т-пилюс, пронзающий в конечном итоге цитоплазматическую мембрану растительной клетки. Тем самым формируется путь, соединяющий цитоплазмы двух клеток и позволяющий в один этап транслоцировать из бактериальной клетки в растительную субстраты системы секреции типа IV (T4SS) - белки и нуклеопротеины.

Параллельно в клетках осуществляется процессинг Т-ДНК. Суть: формирование Т-комплекса. С Т-ДНК Тi-плазмид взаимодействуют белки VirС1, VirD1(нужны для прикрепления VirD2 к концевым повторам Т-ДНК) и VirD2(основной).

Эндонуклеаза VirD2 делает надрез одной нити ДНК и начинается остоединение этой нити от комплементарной ей в направлении левого концевого повтора. Одновременно заполняются образующейся в Т-ДНК бреши новыми нуклеотидами. Отделившейся нить с VirD2-белком на 5’-конце представляет собой Т-комплекс,который направляется к секреторному каналу системы секреции типа 4.

Из-за VirD4 Т-комплекс поступает в канал системы екреции типа 4 и транспортируется в цитоплазму растительной клетки. Так же переносятся белки VirE2,VirE3,VirF.

VirЕ3-считается вспомогательным белком. Молекулы VirЕ2 присоединяются к Т-комплексу по всей длине,защищаяоднонитевую ДНК от расщепления растительными эндонуклеазами и совместно с VirD2 определяют транспорт Т-комплекса в ядро. Далее VirЕ2 связывается с двумя растительными белками VIP1 и VIP2. Эти белки определяют перемещение Т-комплекса из цитоплазмы в нуклеоплазму. Далее VirD2 и VirЕ2 участвуют в процессе интеграции Т-ДНК в хромосомную ДНК растения.

Получение и направления использования трансгенных свиней

Хотят разработать и осуществить трансгеноз свиньи с целью использования органов таких животных для пересадок человеку. Но почти сразу же после пересдаки идет гиперострое отторжение. Оно вызывается осаждением антител на поверхности клеток пересаженного органа и активацией вследствие этого системы комплемента по классическому пути, что, естественно, моментально разрушает клетки. На модели обезъян выяснилось, что основным антигеном, который вызывает образование антител является углеводный компонент поверхностных белков клеток свиньи. Для того что бы это преодолеть можно «подобраться» к генам свиньи, кодирующим поверхностные антигены и изменить их так, чтобы убрать этот углеводный компонент. Так же можно ввести в геном свиньи гены человека, контролирующие образование ингибиторов системы комплемента, защищающих собственные клетки от его действия.

Еще были получены свиньи, продуцирующие человеческий гемоглобин. В этом случае в геном свиньи ввели два гена α-цепи гемоглобина человека, один ген β-цепи гемоглобина и регуляторную область гена β-цепи под промотором свиного гена β-цепи гемоглобина. Перспективы применения таких свиней – приготовление из их крови компонентов кровезаменителей.

В сельскохозяйственном аспекте пытались получить породу быстрорастущих мясных свиней путем введения гена бычьего гормона роста. Трансгенные животные быстрее росли, но у них обнаруживались язвы желудка и кишечника, почечная и сердечная недостаточность, воспаления суставов и снижение защитных свойств слизистой оболочки дыхательных путей.

Билет 26

Вироиды

Вироиды это группа векторов, дающих множество копий вводимой генетической информации. Они являются возбудителями болезней некоторых видов растений и представляют собой небольшие молекулы РНК. Эти РНК способны воспроизводиться в сравнимом с вирусами количестве копий и распространяться по растению при полном отсутствии капсида, что и привлекло к ним внимание специалистов по генетической инженерии.

РНК вироидов является однонитевой ковалентно замкнутой кольцевой молекулой, которая из-за комплементарности большей части последовательности представляет собой суперскрученную палочковидную структуру с небольшими шпилькообразными выступами. Инфицирование растений РНК вироидов легко осуществляется механической инокуляцией, например втиранием в листья.

В круг хозяев вироидов входят как широко распространенные сельскохозяйственные растения (картофель, томаты, баклажан, яблоня, груша, слива, виноград), так и такие тропические и субтропические культуры, как кокосовая пальма, авокадо, цитрусовые, персик. Известны и вироиды, поражающие декоративные культуры – колеус и хризантемы.

К настоящему времени описаны 27 видов вироидов, принадлежащих к восьми родам и двум семействам. Самым обширным является семейство Pospiviroidae (23 вида), типовым для него признан наиболее изученный вироид веретенобразности клубней картофеля - PSTVd (от англ. potato spindle tuber viroid). Остальные виды входят в семейство Avsunviroidae, названное по типовому вироиду солнечного ожога (пятнистости) авокадо – ASBVd (от агл. avocado sunblotch viroid).

Вироиды отличаются от вирусов тем, что могут передаваться в рядах поколений через пыльцу и семена.