Мегаобучалка Главная | О нас | Обратная связь


Ферменты плазмы (сыворотки) крови



2015-11-10 1848 Обсуждений (0)
Ферменты плазмы (сыворотки) крови 0.00 из 5.00 0 оценок




Для исследования активности ферментов чаще всего используются плазма или сыворотка крови. В процессе свертывания крови и последующей ретрак­ции сгустка высвобождаются содержащиеся в тромбоцитах биологически ак­тивные вещества, под влиянием которых возрастает активность многих энзи­мов. Происходящее при этом разрушение форменных элементов (эритроцитов и др.) крови обусловливает дальнейшее увеличение ферментативной активнос­ти, оказывающейся, как правило, в сыворотке более высокой, чем в плазме. Этим, в частности, объясняется известное предостережение не допускать гемолиза, например, при исследовании активности лактатдегидрогеназы крови.

Хранение сыворотки, как правило, сопровождается снижением актив­ности ферментов. Для большинства из них активность не изменяется при комнатной температуре в течение 6—8 ч, около недели — при 4° С и на про­тяжении одного месяца — в замороженном состоянии. Следует учитывать, что многие антикоагулянты способны ингибировать (иногда, напротив, усиливать) деятельность ферментов. Известно, например, что оксалаты по­давляют активность ЛДГ, в то время как салицилаты повышают активность аминотрансфераз.

Используемые в клинико-диагностических лабораториях методы опреде­ления активности ферментов могут быть разделены на две основные группы:

а) состоящие в определении конечного продукта, образовавшегося после известного периода инкубации ферментного препарата (обычно сыво­ротки) с субстратом в соответствующем буфере (метод конечной точки, выполняемый путем измерения опытной и контрольной проб, т.е., по сути, измерение проводится в двух точках). Для этого используется спе­циальная химическая реакция, а учет оптической плотности может быть произведен на обычном ФЭКе;

б) методы, с помощью которых в ходе ферментативной реакции непрерывно или периодически определяют потребление субстрата, кофермента либо образование метаболита. Методы этой группы называю ся кинетическими, или методами непрерывной регистрации.

Активность ферментов выражается количеством разрушенного субстрата или образованного в ходе реакции продукта (в моль, ммоль, мкмоль и т.д.) в пересчете на один литр сыворотки (плазмы) крови при температуре 37, 30, 25°С (SI) либо в международных единицах (Е/л, U/l),a также в каталах (долях катала) на литр, например мккат/л (1 мккат = 60 U; 1 U = 16,67 • 10'3 мккат). Одна единица (U) какого-либо энзима - есть то его количество, которое ка­тализирует трансформацию 1 мкмоль субстрата за 1 мин при определенных условиях.

Определение активности аминотрансфераз

При участии аминотрансфераз (КФ 2.6.1) в организме человека осуществ­ляются процессы межмолекулярного переноса аминогрупп с донорской гам­ма-аминокислоты на акцептор — альфа-кетокислоту без промежуточного об­разования аммония, т.е. трансаминирование (переаминирование: обратимый перенос аминогрупп с аминокислот на кетокислоты) — процесс, открытый российскими учеными Браунштейном и Крицман. |

Трансаминирование играет ключевую роль в промежуточном обмене, таккак обеспечивает синтез и разрушение отдельных аминокислот в организме. Три аминокислоты: глутаминовая, аспарагиновая и аланиновая - благодаря трансаминированию превращаются в соответствующие альфа-кетокислоты, являющиеся компонентами цикла трикарбоновых кислот. Окисляясь в нем, они служат источником энергии.

Трансаминирование имеет существенное значение и в обеспечении цикла мочевины аспартатом.

Простетической группой или коферментом обоих энзимов служит пиридоксальфосфат, осуществляющий перенос аминогруппы за счет способности образовывать пиридоксаминовые производные с аминокислотами.

Аспартатаминотрансфераза — белок с молекулярной массой 110 000 Д. Наиболее богатыми источниками ее являются сердце, печень, скелетная мускулатура, нервная ткань и почки; в поджелудочной железе, селезенке и легких АсT обнаруживается в меньших количествах. Активность фермента в эритроцитах незначительна и составляет приблизительно десятую часть от таковой в плазме: поэтому слабый гемолиз существенно не влияет на величину активности фермента сыворотки (плазмы) крови. Активность же АлТ в эритроцитах в 6 раз превышает таковую в сыворотке (плазме) крови, что следует учитывать при анализировании гемолитической сыворотки. Наиболь­шее количество фермента аланинаминотрансферазы содержится в печени.

Аспартатаминотрансфераза представлена отдельными изоэнзимами, со­ставляющими две основные формы фермента - митохондриальную и раство­римую, содержащиеся как в митохондриях, так и в цитоплазме.

Существующие методы определения активности указанных аминотранс-фераз в сыворотке крови можно разделить на две основные группы: конечной точки (колориметрические, с использованием обычной, не оснащенной сис­темой термостатирования кювет фотометрической аппаратуры) и кинетичес­кие (спектрофотометрические).

Колориметрические методы. В качестве унифицированного в СССР был ут­вержден метод Райтмана-Френкеля, в котором оксалацетат, образованный при переаминировании L-аспартата и альфа-кетоглутаровой кислоты в ще­лочной среде, превращается в пируват, дающий с 2,4-динитрофенилгидразоном гидразон пирувата, оптическую плотность которого измеряют при длинах волн 505-540 нм.

Кинетические методы. Поскольку колориметрическим методам присуще множество недостатков, предпочтение отдается более совершенным кинетическим (спектрофотометрическим), предложенным Кармен еще в 1955 г. Они основаны на проведении сопряженных ферментных реакций, в ходе которых оксалацетат удаляется по мере его образования. Используемая в реакционной смеси НАД-зависимая малатдегидрогеназа является индикаторным ферментом, позволяющим определять активность АсТ по снижению абсорбции монохроматического светового потока (340 нм) вследствие происходящего окис­ления НАДН • Н.

Особый интерес представляют флюориметрические методы определения ак­тивности ферментов, основывающиеся на возможности осуществлять флюориметрический мониторинг светящегося в ультрафиолетовой области восстанов­ленного НАД (НАД • Н) или продуктов, образующихся в пробирке (кювете) за счет воздействия НАД • Н. Образующийся в ходе этой реакции резоруфин обла­дает в 100 раз более интенсивной флюоресценцией, чем восстановленный НАД.

Наиболее часто используемым для определения активности АсТ и АлТ би­ологическим материалом является сыворотка крови, которая не должна иметь следов гемолиза (из-за наличия ферментов в эритроцитах). Активность АсТ (АлТ) стабильна: в течение 24 ч (по некоторым данным, 4 сут) — при комнат­ной температуре (18—25'С), 10 (7) сут при 2—8°С, 14 (30) сут — после замора­живания (-20°С). Вместо сыворотки может быть использована и плазма крови. Для ее получения в качестве антикоагулянтов рекомендуется применять гепа-рин и ЭДТА.

Для исследования активности АсТ предпочтительнее использовать свежую сыворотку крови, взятую в условиях минимального стаза, или плазму крови, по­лученную при добавлении гепарина (не более 0,2 мг/мл), ЭДТА (1 мг/мл), фто-рида (2 мг/мл), оксалата (1 мг/мл) и цитрата (1 мг/мл).

Для исследования активности АлТ также лучше использовать свежую сы­воротку крови, плазму крови применять не следует. АлТ сохраняет свою актив­ность в сыворотке крови на протяжении минимум 4 сут при температуре 4°С.

 



2015-11-10 1848 Обсуждений (0)
Ферменты плазмы (сыворотки) крови 0.00 из 5.00 0 оценок









Обсуждение в статье: Ферменты плазмы (сыворотки) крови

Обсуждений еще не было, будьте первым... ↓↓↓

Отправить сообщение

Популярное:
Генезис конфликтологии как науки в древней Греции: Для уяснения предыстории конфликтологии существенное значение имеет обращение к античной...
Почему люди поддаются рекламе?: Только не надо искать ответы в качестве или количестве рекламы...
Почему двоичная система счисления так распространена?: Каждая цифра должна быть как-то представлена на физическом носителе...



©2015-2024 megaobuchalka.ru Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. (1848)

Почему 1285321 студент выбрали МегаОбучалку...

Система поиска информации

Мобильная версия сайта

Удобная навигация

Нет шокирующей рекламы



(0.008 сек.)