АЛКАЛОИДЫ и гликоалкалоиды

 

К алкалоидам принято относить азотсодержащие органические вещества основного характера, обладающие определенной физиологической активностью. Свое название эти вещества получили от латинского alkali (щелочь), хотя и не все алкалоиды имеют щелочной характер, например, четвертичные соли, слабоосновные или даже кислого характера азотистые гетероциклы. Структура алкалоидов очень разнообразна – от довольно простых алкилароматических аминов (эфедрин) до очень сложных конденсированных гетероциклических систем, в структуре которых содержится от 1 до 4-х атомов азота, многие из которых присущи только данному конкретному алкалоиду или небольшой их группе (резерпин, стрихнин, морфин, соласодин). По этой причине их химическая классификация весьма затруднена, к тому же большинство алкалоидов представлены в каком-либо ряду гетероциклов в единственном виде. Все они обладают основными свойствами, но их отличает большое разнообразие углеродных скелетов, например:

В листьях, траве и корнях красавки, листьях белены и дурмана семейства пасленовых (Solanaceae) доминируют близкие по структуре алкалоиды тропанового типа (гиосциамин + ОН^- ® атропин, скополамин):

 

В траве термопсиса преобладают производные хинолизи-дина и основными являются термопсин, цитизин, пахикарпин:

В траве различных видов крестовников преобладают производные пирролизидина (платифиллин и его N-оксид), в рожках спорыньи – индольные алкалоиды, в корнях барбариса – производные изохинолина и т.д.

 

Число выделенных из растений природных алкалоидов исчисляется тысячами и сотни из них нашли применение в медицине в качестве лекарственных препаратов. Среди алкалоидов широко известны сердечно-сосудистые средства (резерпин), спазмолитики (папаверин, платифиллин), стимуля-торы ЦНС (кофеин), снотворные и наркотические препараты (кокаин, морфин), противомалярийные средства (хинин), противоопухолевые препараты (колхамин, винбластин), т.е. алкалоиды представлены практически во всех фармакологи-ческих группах медицинских препаратов.

В структурах всех типов алкалоидов содержится первичный, вторичный или третичный атомы азота. Различают 11 основных и 5 смешанных групп алкалоидов:

§ алкалоиды без гетероциклов

§ пирролидиновые

§ пирролизидиновые

§ пиперидиновые

§ пиридиновые

§ пиперидиновые и пирролидиновые конденсированные

§ хинолиновые

§ хинолизидиновые

§ изохинолиновые

§ индольные

§ пуриновые

§ дитерпеновые

§ стероидные

§ гликоалкалоиды

§ флавоалкалоиды

§ смешанные

Являясь слабыми основаниями, алкалоиды образуют соли, разлагающиеся при действии щелочей, аммиака, карбонатов с выделением свободных оснований.

Алкалоиды–основания, легко растворимы в спирте, эфире, хлороформе, дихлорэтане. Алкалоиды-соли не растворимы в органических растворителях, кроме спирта.

Часто алкалоиды – оптически активны.

Сумма алкалоидов в одном растении может состоять из 20 и более структур с преобладанием 1-5 соединений в количествах от 0,01 до 15%.

Алкалоиды-основания в растениях связываются с различ-ными кислотами своего растения и в виде солей перемещаются по органам растения.

Подлинность алкалоидсодержащих растений определяют по макро- и микродиагностическим признакам, качественным реакциям и ВЭЖХ после извлечения из лекарственного растительного сырья.

 

Выделение:

1. Измельченное растительное сырье заливают 5% раствором кислоты уксусной в соотношении 1:10, перемешивают на магнитной мешалке в течение 1 часа, фильтруют.

2. 2-3 г препарата заливают 15 мл хлороформа, добавляют 1 мл концентрированного раствора аммиака при перемешивании в течение 1 часа. Хлороформ отфильтровывают (или отделяют в делительной воронке), отгоняют досуха. Сухой остаток растворяют при нагревании в 5 мл 0,1М раствора кислоты хлороводородной, фильтруют. Для проведения качественных реакций, как правило, используют от 1 до 5 мл извлечений.

Качественный анализ [12]:

q Добавляют 1-3 мл реактива Бушарда, Вагнера, Люголя (раствор 1.27 г йода в 100 мл раствора 2 г иодида калия в воде), появляется бурый осадок или окрашивание.

q Добавляют 2-3 мл реактива Майера (1.358 г ртути хлорида растворяют в 60 мл воды, добавляют раствор 5 г калия иодида в 10 мл воды и доводят объем раствора до 100 мл водой), подкисляют до нейтральной или слабо кислой среды, выпадают осадки белого или светло-желтого цвета (все алкалоиды, кроме кофеина и колхицина).

q Добавляют 1-5 мл реактива Драгендорфа (раствор 0.85 г висмута иодида или нитрата основного в 40 мл воды,10 мл кислоты уксусной (раствор 1). 2 г калия иодида растворяют в 50 мл воды очищенной (раствор 2). Смешивают равные объемы растворов 1 и 2, отбирают 10 мл полученной смеси, добавляют 100 мл воды очищенной и 20 мл кислоты уксусной ледяной, взбалтывают 15 минут) [10], выпадают осадки оранжевого, красного или кирпичного цвета (кислые растворы солей алкалоидов), оранжевое окрашивание (стероидные алкалоиды).

q Добавляют 1-3 мл реактива Зонненштейна (1% раствор кислоты фосфорномолибденовой) /Н₇Р(Мо₂О₇)₆·Н₂О/, выпадают осадки белого, желтого или оранжевого цвета, которые при стоянии приобретают синие или зеленые оттенки.

q Добавляют 1-3 мл реактива Шейблера (1% раствор кислоты фосфорновольфрамовой) /Р₂О₅·12WO₃·42Н₂О/, появля-ется осадок разноокрашенный, чаще белого цвета.

q Добавляют 1-3 мл раствора танина (10 г танина растворяют в 90 мл воды очищенной, добавляют 10 мл спирта этилового 96%, перемешивают), выпадают осадки белого или желтого цвета в нейтральной или слабо кислой среде; от до­бавления 1-3 мл 0.1% раствора танина появляется белый осадок, растворимый в избытке реактива (кофеин).

q Добавляют 1-2 мл 1% водного раствора кислоты пикриновой (2,4,6-тринитрофенол), появляется окрашивание или выпадают осадки желтого цвета (все алкалоиды, кроме кофеина, морфина, аконитина, теобромина), атропин осаждается из концентрированных растворов.

q Добавляют 10 капель кислоты хлороводородной разведенной и 10 капель пергидроля, выпаривают на водяной бане досуха. К остатку добавляют 1-2 капли раствора аммиака, появляется пурпурно-красное окрашивание (кофеин).

q Добавляют 1-3 мл реактива Бертрана (1% раствор кремневольфрамовой кислоты) /SiО₂· 12WO₃·2Н₂О/, появляется белый осадок (разные типы алкалоидов).

q
Реакция Витали-Морена. Добавляют 1-3 мл кислоты азотной концентрированной, выпаривают на водяной бане, появляется желтое окрашивание и осадок. При добавлении к осадку 1-3 мл 5% раствора натра едкого спиртового появляется фиолетовое окрашивание или осадок (производные троповой кислоты. Кокаин этой реакции не дает!).

 

q Добавляют 2-3 мл реактива Марме (раствор 10 г иодида кадмия в 100 мл 20% водного раствора калия иодида) /K₂[CdI₄]/, появляется белый или желтый осадок при стоянии постепенно растворимый в избытке реактива (все алкалоиды, кроме кофеина, атропина, колхицина, вератрина).

q Добавляют 1 мл бромной воды, появляется желтое окрашивание (сальсолидин), оранжевое (термопсин), ярко-красное (сальсолин). К 1 мл бромной воды прибавляют 1 мл раствора аммиака концентрированного, появляется зеленое окрашивание (хининовые, хинолиновые алкалоиды, пахикарпин).

q Добавляют 2-3 капли кислоты серной разведенной, появляется голубая флюоресценция (хинин).

q Добавляют 1-2 капли 1% раствора калия перманганата, выпадает фиолетовый осадок (кокаин).

q Добавляют 1-2 капли 3% раствора хлорида железа окисного нагревают 1-3 минуты, появляется зеленое, затем фиолетово-синее окрашивание. При добавлении 1 капли разбавленной кислоты азотной появляется красное окрашивание (морфиновые алкалоиды). При добавлении 1 капли кислоты азотной концентрированной появляется кроваво-красное окрашивание (апоморфин).

q Добавляют 1 мл кислоты азотной концентрированной, нагревают 1-2 минуты, добавляют 1 каплю 0.5 н раствора калия едкого и 1 мл ацетона, появляется фиолетовое окрашивание, исчезающее при стоянии (атропиновые, хининовые алкалоиды).

q Реакция Брэди. Добавляют 1-2 мл раствора 2.4-динитрофенилгидразина в кислоте хлороводородной, выпадает осадок желтого цвета (дигидрокодеинон в отличие от мор­фина, тебаина, кофеина).

q Реакция Фреде. Добавляют несколько капель 5% раствора аммония молибдата в кислоте серной концентри-рованной, появляется фиолетовое окрашивание, переходящее в синее, а при стоянии в зеленое (морфин).

q Реакция Альберта. Добавляют несколько капель 40% раствора формальдегида в сильно кислой среде (реактив Марки), появляется малиновое или малиново-красное окрашивание (морфин – пурпурное ® фиолетовое; кодеин – сине-фиолетовое; малиново-красное - гликоалкалоиды).

q Добавляют 1-3 мл насыщенного раствора сурьмы треххлористой в хлороформе нагревают, появляется кирпично-красное окрашивание (стероидные алкалоиды, стероидные амины).

q Добавляют несколько капель раствора меди сульфата и несколько капель раствора натра едкого, появляется синее окрашивание или осадок. Взбалтывают его с 1 мл эфира. Эфирный слой окрашивается в фиолетово-красный цвет, водный слой остается синим (эфедрин, алкалоиды со вторичной аминогруппой).

q Добавляют 2-3 мл 1% раствора кислоты винной и 1 мл раствора пара-диметиламинобензальдегида, появляется сине-фиолетовое окрашивание (алкалоиды спорыньи).

q Реакция Эрлиха: 1% пара-диметиламинобензальдегид в смеси (25% кислота соляная, этанол безводный 1:1), нагреть до 70⁰С (УФ 254 и 336 нм) (эргокристин, дигидроэргокристин).

q Добавляют 1-3 мл 4% раствора кислоты винной в 50% растворе метанола, нагревают 3 минуты с перемешиванием, охлаждают, добавляют 2-3 мл реактива ван-Урка (К 35 мл воды приливают при перемешивании 65 мл кислоты серной концентрированной и 0.03 мл 10% раствора хлорида железа окисного. Охлаждают до 50⁰С, добавляют 0.2 г пара-диметил-аминобензальдегида. Реактив используют после стояния в течение 24 часов), появляется сине-фиолетовое окрашивание (алкалоиды спорыньи).

q Добавляют 1 мл 5% раствора натрия ацетата, выпадает белый хлопьевидный осадок (наркотин, папаверин). Осадок на часовом стекле смешивают с несколькими кристаллами персульфата калия или аммония и 2 каплями кислоты серной концентрированной, появляется интенсивное красно-бурое окрашивание (наркотин). К фильтрату после отделения осадка добавляют несколько капель 5% раствора натра едкого и 3 мл эфира. Эфирное извлечение испаряют на часовом стекле досуха и к остатку добавляют 2 капли смеси из 1.5 мл формалина и 8.5 мл кислоты серной концентрированной, появляется фиолетовое окрашивание (кодеин).

q Добавляют 1-2 капли кислоты серной концентрирован-ной, появляется оранжевое окрашивание, быстро переходящее при стоянии в желтое (отличие кодеина от морфина).

q Добавляют 1-2 капли кислоты серной концентриро-ванной, 1 каплю 3% раствора хлорида железа окисного нагре-вают 1-2 минуты, появляется синее окрашивание, переходящее в красное при добавлении 1 капли кислоты азотной разведенной (кодеиновые алкалоиды).

q Добавляют 1-2 капли 1% раствора кислоты пикроловой, появляется ярко-желтое окрашивание, при стоянии выпадают осадки (алкалоиды, имеющие в структуре вторичный и третичный азот).

q Добавляют 1 мл 5% раствора натрия нитропруссида и 1 мл 5% натрия гидроксида, появляется вишневое окрашивание (пахикарпин). При добавлении 1 мл кислоты хлороводородной концентрированной сохраняется вишневое окрашивание (пилокарпин, сферофизин).

q Добавляют 1 мл 5% раствора кобальта нитрата, появля-ется голубоватое окрашивание, затем зеленый осадок (цитизин).

q Добавляют 1-2 капли 5% раствора кислоты стифниновой (1,3-диокси-2,4,6-тринитробензол), выпадает осадок желтого цвета (все алкалоиды).

q Добавляют 3 мл реактива Эрдмана (концентрирован-ные серная и азотная кислоты 1:1), появляется различное, чаще желтое окрашивание (алкалоиды-основания).

q Добавляют 1-3 кристалла гидроксиламина («гидрокса-мовая проба», появляется окрашивание, добавляют 1-2 мл 3% раствора железа окисного хлорида, окраска меняется до красно-фиолетовой (платифиллин, сложные эфиры).

 

Хроматографический анализ:

Помимо качественных реакций на различные группы алкалоидов, для обнаружения и идентификации, разделения и контроля степени очистки используют методы бумажной (БХ), тонкослойной (ТСХ), газожидкостной (ГЖХ) или высоко-эффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Для бумажной хроматографии используют системы: н-бутанол – уксусная кислота – вода (4:1:5), (10:2:3), (40:12.5:29); н-бутанол – соляная кислота – вода (100:4:до насыщения) с последующей обработкой сухих хроматограмм реактивом Драгендорфа (оранжевые, оранжево-красные на желтом фоне).

Для обнаружения алкалоидов на БХ используют пары йода (бурые пятна).

Стероидные алкалоиды идентифицируют по кирпично-красному окрашиванию от действия треххлористой сурьмы в хлороформе.

ТСХ на пластинках алюминия оксида может быть использована для качественного и количественного анализа, для разделения алкалоидов различной основности и пространствен-ного строения.

Возможно использование силикагеля КСК и кремниевой кислоты (для хроматографии).

Для любых сорбентов пригодны системы: хлороформ – метиловый спирт – уксусная кислота (18:1:1), (10:3:3); хлороформ – этиловый спирт (9:1), (8:2); ацетон – аммиак (95:5) и (90:10).

Для анализа фармакологически активных алкалоидов часто используют обращенно-фазовое ВЭЖХ разделение на колонке с Zorbax Eclipse XDB-C (5 мкм). В качестве подвижной фазы служит смесь 0.1М фосфорной кислоты и ацетонитрила (85:15, v/v), с использованием УФ-детектора (330 нм); хорошие результаты были также получены при градиентном элюировании смесью 0.005М Na₂HPO₄ (pH доведен H₃PO₄ до 6) и ацетонитрила от 80:20 до 20:80 за 20 мин, при использовании УФ детектора (306 нм) [14]. Оптимальным, по мнению немецких ученых, является ВЭЖХ анализ алкалоидов на колонке с Octadecyl-C₁₈ (5 мкм) сорбентом, с использованием в качестве подвижной фазы смеси: метанол – 25% аммиак (10:0.2), при использовании УФ детектора (274 и 337 нм) [15].Убедительные результаты были получены с использованием в качестве неподвижной фазы LiChrospher-100 RP₁₈, (5 мкм). Подвижной фазой служил 70% метанол в 0.01М ацетамиде при pH 8.04 (УФ-детектор 225 нм) [16]. Группой проф. Матсуды (Япония) для разделения и анализа растительных алкалоидов была использована колонка с SS Васкосилом II 5C₁₈ RS (5 мкм). Элюирование проводили смесью ацетонитрила с водой при увеличении содержания ацетонитрила от 26 до 52% в течение 40 минут с использованием УФ-детектора с рабочей длиной волны 280 нм [17].

 

Количественное определение:

Для выбора методики количественной оценки содержания алкалоидов в сырье предварительно необходима идентификация групповой принадлежности этих соединений по макро-, микродиагностическим признакам сырья и по качественным реакциям, описанным практически для всех групп алкалоидов.

В связи с разнообразием химического строения алкалоидов и их состоянием в сырье, используют различные методы их извлечения. Если алкалоиды присутствуют в виде солей, их можно извлекать водой с последующим переводом в основания под действием аммиака и органического растворителя.

Если алкалоиды присутствуют в виде оснований, их переводят в солеобразное состояние добавлением кислоты, например, хлороводородной с последующим титрованием избытка кислоты натрия гидроксидом.

Гликозидированные формы алкалоидов предварительно гидролизуют добавлением кислот при нагревании.

Ниже приводятся примеры методик на наиболее часто встречающиеся группы алкалоидов как с использованием СО, так и без них.

Метод 1. Около 1 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в коническую колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 10 мл 25% раствора натрия гидроксида, перемешивают стеклянной палочкой до получения увлажненной массы и оставляют при комнатной температуре на 2 часа. Затем прибавляют 50 мл хлороформа, осторожно перемешивают и оставляют на 30 минут.

Не взмучивая раствора, пипеткой отбирают 15 мл извлечения в делительную воронку вместимостью 100 мл и трижды извлекают алкалоиды 2% раствором кислоты серной порциями 20, 10 и 10 мл до отрицательной реакции с кремневольфрамовой кислотой.

Объединенные кислотные извлечения фильтруют в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора до метки 2% раствором кислоты серной и измеряют оптическую плотность при длине волны 420 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя в качестве раствора сравнения 2% раствор кислоты серной.

Содержание алкалоидов в пересчете на берберина бисульфат в процентах (Х) вычисляют по формуле:

 

X =

50 ^. 50 ^. D ^. 100 ^. 100

15 ^. 128 ^. m ^. (100 - W)

 

где 50 - объем хлороформного извлечения, в миллилитрах;

50 - объем сернокислотного извлечения, в миллилитрах;

15 - объ­ем хлороформного извлечения, взятого для анализа, в миллилитрах;

D – оптическая плотность сернокислотного извлечения;

128 – удельный показатель поглощения берберина бисульфата при длине волны 420 нм;

W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах;

m - масса навески сырья, в граммах [11];

* Возможно использование других СО и других длин волн, например:

646 – удельный показатель поглощения берберина бисульфата при длине волны 345 нм;

434 – удельный показатель поглощения цитизина при длине волны 311 нм (если алкалоиды анализируемого растения содержат или близки по структуре цитизину).

Метод 2. Около 1 г (точная навеска) измельченного сырья или порошка растертых таблеток помещают в коническую колбу, прибавляют 10 мл 2% раствора кислоты лимонной и 30 мл хлороформа, оставляют при перемешивании в течение 1 часа. Хлороформный слой сливают в делительную воронку, а сырье еще раз экстрагируют хлороформом.

Хлороформные извлечения объединяют, обрабатывают 10 мл 1% раствора натрия гидрокарбоната, фильтруют через слой безводного натрия сульфата в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора до метки хлороформом и перемешивают.

20 мл полученного хлороформного извлечения помещают в колбу, хлороформ отгоняют досуха при температуре около 40⁰С.

Сухой остаток переносят 4 мл спирта этилового 95% в мерную колбу вместимостью 25 мл, добавляют 2 мл раствора 0.25М кислоты серной, 2 мл свежеприготовленного 0.3% раствора натрия нитрита, выдерживают 30 минут при температуре водяной бани 55±5⁰С.

Раствор охлаждают, добавляют 1 мл свежеприготовленного 5% раствора кислоты сульфаминовой, доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 95% и измеряют оптическую плотность раствора при длине волны 390 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.

В качестве раствора сравнения используют раствор из 2 мл 0.25М раствора кислоты серной, 1 мл 5% раствора кислоты сульфаминовой в мерной колбе вместимостью 25 мл с доведенным до метки объемом спиртом этиловым 95%.

Содержание алкалоидов в абсолютно сухом сырье в пересчете на резерпин в процентах (Х) вычисляют по формуле:

 

X =

D ^. (b) ^. 50 ^. 25 ^. 100 ^. [100]

402 ^. m ^. 20 ^. [(100 - W)]

 

где D – оптическая плотность испытуемого раствора при длине волны 390 нм;

m - масса навески сырья, в граммах;

(b) – средняя масса препарата (таблетки, драже, капсулы…), в граммах;

402 – удельный показатель поглощения резерпина при длине волны 390 нм;

W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах.

Примечания. Приготовление 2% раствора кис-лоты лимонной. 2 г кислоты лимонной растворяют в воде очищенной в мерной колбе вместимостью 100 мл, доводят объем раствора до метки водой очищенной и перемешивают. Раствор годен в течение 6 месяцев.

Приготовление 1% раствора натрия гидро-карбоната. 1 г натрия гидрокарбоната растворяют в воде очищенной в мерной колбе вместимостью 100 мл, доводят объем до метки водой очищенной и перемешивают. Раствор годен в течение месяца.

Приготовление 0,3% раствора натрия нитри-та. 0.3 г натрия нитрита растворяют в воде очищенной в мерной колбе вместимостью 100 мл, доводят объем раствора до метки водой очищенной и перемешивают.

Приготовление 5% раствора кислоты сульфа-миновой. 5 г кислоты сульфаминовой растворяют в воде очищенной в мерной колбе вместимостью 100 мл, доводят объем до метки водой очищенной и перемешивают.

Растворы используют свежеприготовленными.

Приготовление 0.25М раствора кислоты серной. 50 мл 0.5М раствора кислоты серной помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора до метки водой очищенной и перемешивают. Раствор годен в течение 6 месяцев.

 

Метод 3. Около 2 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 30 мл хлороформа или этилацетата, 5 мл раствора аммиака, выдер-живают с обратным холодильником в течение 1 часа, затем при нагревании на водяной бане при температуре 50-60⁰С в течение 2 часов. Охлаждают, фильтруют и трижды экстрагируют алкалоиды 1% раствором кислоты хлороводородной порциями по 20, 15 и 10 мл.

Кислотные извлечения объединяют, подщелачивают раствором аммиака до щелочной реакции по фенолфталеину и алкалоиды извлекают хлороформом порциями по 20, 15 и 10 мл до отрицательной реакции с реактивом Майера или раствором кислоты кремневольфрамовой.

Объединенные хлороформные извлечения фильтруют через слой прокаленного натрия сульфата и отгоняют досуха на водяной бане. (*)

Сухой остаток растворяют при нагревании на водяной бане в 15 мл 0.02М раствора кислоты хлороводородной, прибавляют 2 капли метиленового красного, 1 каплю метиленового синего и избыток кислоты хлороводородной оттитровывают 0.02М раст-вором натрия гидроксида до появления зеленой окраски. (**)

Содержание алкалоидов а абсолютно сухом сырье в пересчете на гиосциамин в процентах вычисляют по формуле:

 

X =

(15 – V) ^. 0.00578 ^. 100 ^. 100

m ^. (100 - W)

 

где V - объ­ем 0.02М раствора натрия гидроксида, израсхо-дованный на титрование, в миллилитрах;

m - масса навески сырья, в граммах;

W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах;

0.00578 – количество алкалоидов в пересчете на гиосциамин, соответствующее 1 мл 0.02М раствора кислоты хлороводородной в граммах;

* Методику можно видоизменить: на отмеченной стадии сухой остаток высушивают до постоянного веса и рассчитывают содержание суммы алкалоидов весовым методом от взятой навески с учетом влажности сырья.

** Можно использовать другие СО и, соответственно, использовать другие коэффициенты пересчета, например.

** 0.0122 – количество суммы алкалоидов в пересчете на термопсин, соответствующее 1 мл

0.05М раствора кислоты хлороводородной в граммах [18];

** 0.0244 – количество алкалоидов в пересчете на термопсин, соответствующее 1 мл 0.1н

раствора кислоты хлороводородной в граммах [19].

*** - сухой остаток растворяют в 10 мл кислоты уксусной, прибавляют 2 капли раствора кристаллического фиолетового и титруют 0.02М раствором кислоты перхлорной до изменения окраски на голубую, если в сырье присутствуют алкалоиды типа цитизина, соласодина.

4.09 – количество алкалоидов в пересчете на метилцитизин, соответствующее 1 мл 0.02М раствора кислоты перхлорной, в миллиграммах.

0.04137 – количество алкалоидов в пересчете на соласодин, соответствующее 1 мл 0.1М раствора кислоты хлоро-водородной, в миллиграммах.

 

Метод 4. (при наличии СО любых алкалоидов). Точную навеску сырья или 5 мл испытуемого раствора (препарата, извлечения или элюата) помещают в мерную колбу на 100 мл, прибавляют 20 мл спирта этилового 95%, перемешивают в течение 15 минут, доводят объем раствора спиртом этиловым 95% до метки, перемешивают.

По 20 мкл испытуемого раствора и раствора СО хроматографируют на жидкостном хроматографе с УФ-детектором получая не менее 5 хроматограмм для каждого раствора в следующих условиях (например):

§ колонка 150х4.6 мм, сорбент Зорбакс, размер частиц 5 мкм или аналогичная;

§ подвижная фаза: ацетонитрил – 0.1М раствор аммония карбоната (55:45), дегазированная любым способом;

§ скорость потока – 1 мл/мин;

§ температура колонки 45⁰С;

§ детектирование при длине волны 225 нм.

Содержание алкалоидов в мг вычисляют по формуле:

 

X =

S₁ ^. m₀ ^. 100 ^. P ^. [100]

S₀ ^. m ^. 5 ^. [(100 - W)]

 

где S₁ – среднее значение площадей пиков анализируемого раствора соответствующих алкалоидам;

S₀ – среднее значение площадей пиков СО алкалоида;

m₀ – масса навески СО алкалоида, в миллиграммах;

m – масса навески сырья, в миллиграммах;

W - потеря в массе при высушивании сырья, в процентах;

Р – содержание алкалоида в СО алкалоида, в процентах.

Примечания. Приготовление 0.1М раствора аммония карбоната. 7.8 г аммония карбоната помещают в мерную колбу вместимостью 1 л, растворяют в 700 мл воды очищенной, доводят объем раствора до метки водой очищенной и перемешивают.

Результаты анализа достоверны, если выполняется требова-ние теста «Проверка пригодности хроматографической системы».

 

Метод 5. Около 5 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в аппарат Сокслета или в колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 10 мл 8% раствора аммония гидроксида, 50 мл хлороформа и экстрагируют на кипящей водяной бане в течение 3 часов. Хлороформ отгоняют до объема 10-15 мл и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем хлороформом до метки и перемешивают (раствор А).

На хроматографическую пластинку наносят 0.2 мл полученного раствора в виде полосы 4 см. На расстоянии 2 см от испытуемого раствора в качестве свидетеля наносят 0.005 мл 1% раствора СО, например колхамина, пластинку подсушивают на воздухе. Затем помещают в камеру и хроматографируют в системе растворителей хлороформ – спирт метиловый (24:1) восходящим способом.

Хроматограмму просматривают в УФ-свете, отмечая пятно СО и пятно, совпадающее по положению и цвету в анализируемом растворе. Вырезают пятна СО, испытуемого раствора и пустого слоя, помещают в стаканы, элюируют 15% раствором кислоты хлороводородной, отфильтровывают в мерную колбу вместимостью 25 мл, объем элюатов доводят тем же раствором до метки и перемешивают (раствор Б).

Измеряют оптическую плотность полученного раствора при длине волны 364 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя в качестве раствора сравнения воду очищенную.

Параллельно измеряют оптическую плотность раствора СО.

Содержание алкалоидов в сырье, в пересчете на СО в процентах (Х) вычисляют по формуле:

 

X =

D₁ ^. Р ^. V₁ ^. V₃ ^. 100 ^. 100

D₀ ^. m ^. V₂ ^. (100 - W)

 

где V₁ - объем хлороформного извлечения А, в мл;

V₂ - объем извлечения А, нанесенного на пластинку, в мл;

V₃ - объ­ем раствора Б, в мл;

D₁ – оптическая плотность раствора СО при l_max 364 нм;

D₀ – оптическая плотность раствора Б при l_max 364 нм;

m - масса навески сырья, в граммах;

W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах;

Р – содержание алкалоида в 1 мл раствора СО, в граммах.

* - если СО – колхамин, Р=0.00002 при длине волны 364 нм.

 

Стрихнин и бруцин. 0.5 г (точная навеска) измельченного в порошок сырья помещают в фарфоровую чашку, прибавляют 10 мл спирта этилового 96%, 1 мл 10% раствора кислоты серной, перемешивают и выпаривают на водяной бане досуха.

После охлаждения к остатку прибавляют 2 мл воды очищенной, 6 г алюминия оксида для хроматографии и заполняют колонку для хроматографии длиной 20-25 см.

Алкалоиды элюируют хлороформом со скоростью 1-2 капли в секунду.

10 мл элюата разбавляют хлороформом в колбе вместимостью 50 мл и измеряют оптическую плотность полученного раствора при длине волны 257 и 304 нм, относительно раствора сравнения – хлороформа.

Содержание стрихнина и бруцина в абсолютно сухом сырье в процентах (Х) рассчитывают по формуле:

 

Стрихнин: Х =

D₂₅₇ ^. (1.279 – D₃₀₄) ^. 0,325 ^. 100

m ^. (100 - W)

 

Бруцин: X =

D₃₀₄ ^. (0.467 – D₂₅₇) ^. 0,024 ^. 100

m ^. (100 - W)

 

где D₂₅₇ – оптическая плотность испытуемого раствора при длине волны 257 нм;

D₃₀₄ – оптическая плотность испытуемого раствора при длине волны 304 нм;

m – масса навески сырья, в граммах;

W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах.

Гликоалкалоиды – это производные циклопентанопер-гидрофенантрена, по свойствам аналогичны стероидным сапонинам и алкалоидам.

В основе их структуры – азотсодержащие аналоги сапонинов или стероидов, например:

Углеводная часть может быть представлена D-глюкозой, D-галактозой, L-рамнозой, L-арабинозой, D-ксилозой, D-глюкуро-новой и D–галактуроновой кислотами.

Гликоалкалоиды – оптически активны, растворимы в горячем спирте, в виде солей растворимы в воде, гидролизуются при нагревании с кислотами.

Для их выделения из растений используют экстракцию разбавленными кислотами с последующим осаждением аммиаком, а также метод твердо-фазной экстракции на колонке Sep-Pak C₁₈, с использованием в качестве подвижной фазы смеси метанол – 0.1М кислота хлороводородная (8:2), после предварительного исчерпывающего элюирования сопутству-ющих веществ водой, аммония бикарбонатом и смесью равных объемов метанола и аммония бикарбоната [20].

Для разделения гликоалкалоидов используют вариант колоночной хроматографии на оксиде алюминия II и III степеней активности, элюируя смесью бензола с хлороформом.

Для разделения и анализа гликоалкалоидов может быть также использован метод ВЭЖХ на колонке с Techsphere 80 C₁₈ сорбентом и использованием в качестве подвижной фазы смеси ацетонитрил - 0.01M солянокислый буфер (40:60 v/v) при pH 7.8 (УФ-детектор, 203 нм) [21].

Гликоалкалоиды осаждаются холестерином, дигитонином, дают окрашивание с п-оксибензальдегидом, анисовым альдегидом, резорцином, формальдегидом [11].

Для проведения качественных реакций сырье заливают 5% раствором уксусной кислоты, взбалтывают в течение 40 минут, фильтруют.

q К 1 мл извлечения добавляют несколько капель 1% спиртового раствора холестерина – гликоалкалоиды выпадают в осадок.

Количественный анализ осуществляют методами титрования кислотой хлороводородной, потенциометрией, весовым и колориметрическим методами [11].

Ниже приведены наиболее воспроизводимые методики анализов.

 

Метод 1. Около 3 г сырья (точная навеска) помещают в колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 5% раствора кислоты уксусной, нагревают при перемешивании на кипящей водяной бане в течение 4 часов, охлаждают и фильтруют.

20 мл фильтрата помещают в колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 6 мл 25% раствора аммиака, нагревают на кипящей водяной бане в течение 2 часов, быстро охлаждают льдом. При этом сумма алкалоидов осаждается. Осадок отфильтровывают, высушивают на воздухе. Фильтр с осадком гликоалкалоидов помещают в колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 30 мл спирта этилового 95% и экстрагируют при нагревании на водяной бане с обратным холодильником 30-40 минут. Экстрагирование повторяют до отрицательной реакции с раствором формальдегида в кислоте серной или с йодом. Спиртовые извлечения отгоняют досуха.

К сухому остатку прибавляют 5-10 мл 1% раствора кислоты уксусной и растворяют гликоалкалоиды при слабом нагревании на водяной бане.

К уксуснокислому раствору гликоалкалоидов прибавляют 5-10 мл 25% раствора аммиака, нагревают до 60-65⁰С, затем охлаждают на льду. Выпавшие гликоалкалоиды отфильтро-вывают через предварительно высушенный фильтр, промывают 1% раствором аммиака до обесцвечивания фильтрата и высушивают в сушильном шкафу при температуре 80-90⁰С до постоянной массы.

Метод 2. Полученный сухой остаток суммы гликоалкало-идов растворяют в 100 мл спирта этилового 95% при нагревании на водяной бане в течение 30-40 минут. При наличии значи-тельного количества гликоалкалоидов экстракцию спиртом повторяют еще 2-3 раза.

Полноту извлечения гликоалкалоидов определяют по отсутствию окрашивания с парами йода или раствором формальдегида в кислоте серной.

Спиртовые извлечения отгоняют досуха, сухой остаток промывают 1% раствором аммиака до его обесцвечивания, высушивают при температуре 80-90⁰С. Сухой остаток растворяют в 100 мл спирта этилового 95% и титруют потенциометрически 0.1н раствором кислоты хлороводородной.

1 мл 0.1н раствора кислоты хлороводородной соответствует 0.04137 г соласодина.

Содержание гликоалкалоидов в процентах (Х) в абсолютно сухом сырье вычисляют по формуле:

 

X =

V ^. 0.04137 ^. V₁ ^. 100 ^. 100

m ^. V₂ ^. (100 - W)

 

где V - объем 0.1н раствора кислоты хлороводородной, израс-ходованной на титрование в миллилитрах;

V₁ - объем 5% раствора кислоты уксусной, пошедшей на экстракцию гликоалкалоидов в миллилитрах;

V₂ - объ­ем фильтрата, взятый для осаждения гликоалкало-идов аммиаком в миллилитрах;

m - масса навески сырья, в граммах;

W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах.