Работа 17. Окисление клетчатки

Аэробное разложение, или окисление клетчатки (целлюлозы) проходит в две фазы. Первая фаза – это гидролиз под действием выделяемых микроорганизмами экзоферментов до β-глюкозы, а вторая фаза – это полное окисление поглощенной микробами β-глюкозы до углекислого газа и воды:

                      целлюлаза                               целлобиаза

(С₆Н₁₀О₅)n + nН₂О ¾¾® nС₁₂Н₂₂О₁₁ + nН₂О ¾¾®

        целлюлоза                            целлобиоза

nC₆Н₁₂О₆ + О₂ ® СО₂ + Н₂О.

           β-глюкоза

Постановка опыта. В работе используют метод почвенных пластинок Кристенсена. Чашку Петри заполняют почвой слоем около 1 см, предварительно увлажнённой водой или средой Гетчинсона следующего состава, г: NaNO₃ – 2,5, K₂HPO₄ – 1,0, MgSO₄ – 0,3, CaCl₂ – 0,1, NaCl – 0,1, FeCl₃ – 0,01, вода дистиллированная – 1000 мл. Поверхность почвы выравнивают шпателем, сверху накладывают кружок фильтровальной бумаги и плотно прижимают к поверхности среды, чашки помещают в термостат, при 27-30 ºС. Периодически смачивают почву в чашке водой, но не допускают того, чтобы вода полностью заливала фильтровальную бумагу, и не развивались бы на фильтровальной бумаге анаэробные целлюлозоразлагающие бактерии.

Результаты опыта. Через 4-5 суток после постановки опыта на бумаге появляются пигментные зоны и ослизненные участки, указывающие на разрушение клетчатки. Через 1,5-2 недель их можно микроскопировать.

Микроскопирование. Для микроскопического изучения аэробных целлюлозоразлагающих бактерий бактериологической петлей берут немного слизи, покрывающей фильтровальную бумагу, растирают её на предметном стекле, фиксируют мазок в пламени и окрашивают кристаллвиолетом 30-60 с. Препарат рассматривают, пользуясь иммерсионной системой микроскопа.

Возбудителями аэробного разложения клетчатки являются бактерии, актиномицеты, плесневые грибы. Наибольшее значение имеют бактерии. К ним относятся миксобактерии, цитофаги и вибрионы. Миксобактерии образуют яркоокрашенные слизистные плодовые тела на разлагающейся древесине. На фильтровальной бумаге в нашем опыте развиваются в основном цитофаги и вибрионы.

Цитофаги – Cytophaga – крупные длинные слегка изогнутые палочки с острыми краями.

Вибрионы: Cellvibrio – мелкие тонкие изогнутые клетки и Cellfalcicula – мелкие короткие толстые изогнутые клетки с заостренными концами.

Характеристика аэробных целлюлозоразлагающих бактерий: грамотрицательные, палочки и вибрионы, подвижные, неспоровые.

Зарисовывают и описывают аэробные целлюлозоразлагающие бактерии в тетради.

Материалы и оборудование: чашки Петри, среда Гетчинсона, дистиллированная вода, почва, простерилизованные кружки фильтровальной бумаги, шпатели, кристаллвиолет.

Работа 18. Окисление спирта в уксусную кислоту

Типичным примером процессов неполного окисления является окисление спирта в уксусную кислоту:

СН₃СН₂ОН + О₂ ® СН₃СООН + Н₂О.

При неполном окислении вещества окисляется не до СО₂ и Н₂О, а до различных органических кислот, имеющих применение в народном хозяйстве. Окисление спирта в уксусную кислоту используют в производстве уксуса из вина и спирта.

Постановка опыта. В колбы наливают по 30-50 мл непасте-ризованного пива или лёгкого вина (виноградного, яблочного или ягодного) и добавляют 5-10 мл 10 %-ной уксусной кислоты для подкисления среды. Помещают в термостат при температуре 25-30 ºС.

Результаты опыта. Через несколько дней (2-6) на поверхности среды появляется серовато-белая плёнка уксуснокислых бактерий.

Препаровальными иглами переносят небольшие кусочки плёнки с поверхности скисшего пива или вина в фарфоровую чашку и на предметное стекло.

Определение вида уксуснокислых бактерий. Добавляют к плёнке в фарфоровой чашке несколько капель раствора Люголя и устанавливают реакцию на йод.

Микроскопирование. Для микроскопического исследования бактериальную пленку на предметном стекле аккуратно расправляют, фиксируют в пламени, окрашивают кристаллвиолетом 30-60 с, рас-сматривают с иммерсией.

Уксуснокислые бактерии широко распространены в природе, встречаются на зрелых плодах, ягодах, в квашеных овощах, вине, пиве, квасе. Они были открыты Л. Пастером в 1868 г.

На пиве и вине хорошо развиваются:

Acetobacter aceti – типичные уксуснокислые бактерии, образуют на поверхности гладкую слизистую пленку, окрашивающуюся йодом в жёлтый цвет. Развиваются при относительно низких температурах

(20-22 ºС);

Acetobacter pasteurianum – образуют на поверхности среды морщинистую сухую плёнку, окрашивающуюся йодом в синий цвет. Оптимальная температура развития 30-34 ºС.

Характеристика уксуснокислых бактерий. Грамотрицательные. Представляют собой короткие палочки, расположенные цепочками, неспоровые, в основном подвижные, строгие аэробы – образуют плёнки на поверхности среды, отличаются высокой устойчивостью к кислотам (ацидофильные).

Зарисовывают и описывают уксуснокислые бактерии в тетради.

Материалы и оборудование: пиво или лёгкое вино в плоскодонных колбах на 100 мл, 10 %-ная уксусная кислота, цилиндры, препаровальные иглы, кристаллвиолет, раствор Люголя, фарфоровые чашки.