Работа 23. Свободноживущие азотфиксирующие микроорганизмы

Микроорганизмы, обитающие в почве самостоятельно и способные использовать молекулярный азот атмосферы для построения своего органического вещества, называются свободноживущими азотфиксаторами. После их отмирания в почве происходит минерализация органического азота до аммиака, доступного для питания растений. Масштабы поступления биологического азота в почву за счёт деятельности свободноживущих в ней азотфиксаторов значительны и могут составлять 15-50 кг азота на гектар и более.

Свободноживущие азотфиксирующие микроорганизмы делятся на анаэробные и аэробные.

1. Аэробный свободноживущий азотфиксатор Clostridium pasteurianum

Этот микроб был открыт в 1893 г. С.Н. Виноградским и назван в честь Л. Пастера. Энергию, получаемую в результате маслянокислого брожения органических форм углерода (моно-, ди- и полисахаридов), использует на связывание молекулярного азота. Азотфиксирующая способность составляет 10-12 мг азота на 1 г сброженного сахара. Эти микроорганизмы встречаются во всех почвах.

Постановка опыта. Для создания накопительной культуры Clostridium pasteurianum используют безазотистую среду Виноградского следующего состава, г: глюкоза – 20,0; К₂НРО₄ – 1,0; MgSO₄ – 0,5; NaCl – 0,5; вода дистиллированная – 1000 мл.

Среду разливают в высокие пробирки на 2/3 их объема, добавляют 0,5 г мела (для нейтрализации масляной кислоты) и заражают 1 г почвы. Пробирки закрывают ватными пробками, оборачивают пробки бумагой, подписывают. Подготовленные пробирки пастеризуют при температуре 60 °С в течение 30 мин, а затем помещают в термостат при 25-30 °С.

Элективные условия для развития Clostridium pasteurianum:

1) отсутствие в среде азота;

2) анаэробные условия за счёт высокого столбика среды в пробирке;

3) присутствие глюкозы, необходимой для маслянокислого брожения;

4) нейтральная среда за счёт мела;

5) необходимый набор элементов минерального питания;

6) пастеризация уничтожает неспоровые формы, а бациллы остаются.

Результаты опыта. Через неделю пробирки исследуют. Отмечают выделение газов и масляной кислоты в результате брожения.

Микроскопирование. Для исследования микробов бактериологической петлей проводят по стенке в нижней части пробирки, где в осадке мела, часто покрытые пленкой, накапливаются клостридиумы. Быстро переносят микробы на предметное стекло и готовят препарат-мазок, фиксированный в пламени и окрашенный кристаллвиолетом (30-60 с). Рассматривают, пользуясь иммерсионной системой микроскопа.

Характеристика Clostridium pasteurianum. Являются типичными маслянокислыми бациллами. Грамположительные. Клетки представляют собой крупные палочки шириной 0,8-1,3 и длиной 1,5-8 мкм, подвижные (перитрихи), споровые (спорообразование клостридиальное, клетки имеют вид веретена), откладывают в теле гранулёзу, облигатные анаэробы, гетеротрофы.

Зарисовывают в тетради споровые формы.

2. Аэробный свободноживущий азотфиксатор Азотобактер ( Azotobacter chroococcum)

Азотобактер впервые выделен в чистой культуре голландским ученым М. Бейеринком в 1901 г. В настоящее время известно около 10 видов азотобактера. Наиболее распространенным и хорошо изученным является Azotobacter chroococcum – обитатель почв всех типов, кроме кислых. Образует на плотной питательной среде Эшби колонии с бурым, почти чёрным пигментом. Для Azotobacter agilis характерны бесцветные колонии, Azotobacter vinelandii дает флуоресцирующую желтовато-зеленоватую окраску колоний. Азотфиксирующая способность у азотобактера составляет 15-20 мг азота на 1 г потребляемого органического вещества.

Постановка опыта. Для выявления азотобактера в почве и определения относительного его содержания пользуются методом почвенных комочков. Для этого используют агаризованную питательную среду Эшби следующего состава, г: маннит или глюкоза – 20,0; К₂НРО₄ – 0,2; MgSO₄ – 0,2; NaCl – 0,2; K₂SO₄ – 0,1; CaCO₃ – 5,0; агар-агар – 20,0; вода дистиллированная – 1000 мл.

Приготовленную среду разливают в чашки Петри и дают ей застыть. Для оценки плодородия почв по плотности населения в них азотобактера можно использовать две различные по плодородности почвы. Тогда дно чашки карандашом по стеклу делят на две равные части и отмечают их цифрами (1 и 2). Производят посев комочков почвы диаметром примерно 2 мм с помощью стеклянной палочки, смоченной в воде (25 комочков почвы № 1 на половину чашки с номером один и 25 комочков почвы № 2 на половину чашки с номером два). Комочки раскладывают на некотором расстоянии друг от друга и хорошо смачивают водой.

Чашки закрывают, оборачивают бумагой, подписывают и помещают в термостат при температуре 28-30 °С.

Элективные условия для развития азотобактера:

1) отсутствие в среде азота;

2) аэробные условий, так как посев поверхностный;

3) присутствие в среде маннита, фосфора и минеральных элементов для питания;

4) нейтральная среда за счёт мела;

5) достаточная влажность при хорошем увлажнении комочков.

Результаты опыта. Посеянные чашки исследуют через неделю.

Определение плотности населения азотобактера. Подсчитывают комочки почвы, вокруг которых появились густослизистые бесцветные, светло-коричневые или тёмно-бурые колонии азотобактера. Выражают число комочков обрастания в процентах от общего количества разложенных комочков отдельно для каждой почвы. Сравнивают эти показатели у анализируемых почв и делают выводы об их плодородии.

Азотобактер очень требователен к плодородию почвы. Почва должна быть нейтральной (рН 7,2-7,4), структурной (аэрируемой), с влажностью 60-80 % ПВ, богатой органическим веществом, фосфором, микроэлементами (Мо, В). Присутствие азотобактера в почве является показателем её окультуренности и плодородия.

Микроскопирование. Для знакомства с азотобактером из неподсохших блестящих слизистых колоний готовят препарат-мазок, фиксированный в пламени и окрашенный метиленовым синим

(2-3 мин). Рассматривают с иммерсией.

В нашем опыте хорошо развивается Azotobacter chroococcum.

Характеристика азотобактера: грамотрицательный, по форме встречаются кокки, палочки и цисты. Имеет ясно выраженный цикл развития. В молодой культуре клетки имеют форму крупных, коротких палочек с закругленными концами (размером 3×6 мкм), подвижные (перитрихи), неспоровые. С возрастом клетки азотобактера принимают округлую форму, становятся крупными кокками (диаметром 4 мкм) и теряют подвижность. Кокки соединены по две или четыре клетки и покрыты общей толстой слизистой капсулой. Содержат запасные вещества волютин и гликоген. Именно эти клетки и фиксируют азот атмосферы. Азотобактер очень влаголюбив – при нехватке влаги становится цистами – покоящимися клетками, покрытыми плотной оболочкой. Аэроб. Гетеротроф.

Из Azotobacter chroococcum готовят бактериальное удобрение – азотобактерин (ризофил), которым обрабатывают семена различных культур (овощных, картофеля, зерновых) перед посевом для улучшения азотного питания растений и ростстимулирующего действия в результате деятельности микроорганизмов.

Зарисовывают в тетради азотобактер и делают поясняющие подписи.

Материалы и оборудование: для посева клостридиума - колбы со средой Виноградского, фарфоровые чашки с почвой и ложечками, а также чашки с мелом и ложечками, высокие пробирки с ватными пробками, полоски бумаги для обертывания пробирок, водяная баня;

для посева азотобактера – чашки Петри со средой Эшби, две чашки Петри с различными почвами и два стаканчика с дистиллированной водой и стеклянными палочками, бумага для обёртывания чашек;

для микроскопирования – кристаллвиолет и метиленовый синий.