Работа 20. Аммонификация белковых веществ

Аммонификация – это разложение органических азотсодержащих веществ с выделением азота в виде аммиака (NH₃). Этот процесс называется также минерализацией азота или гниением. В почву белковые вещества попадают с остатками отмерших растений, животных, микроорганизмов, с органическими удобрениями. При аммонификации белковых веществ выделяется аммиак, углекислый газ, при анаэробном распаде могут образовываться дурнопахнущие продукты – сероводород, меркаптаны, скатол, индол, кадаверин (трупные яды).

Постановка опыта. Для выращивания аммонифицирующих бактерий используют мясопептонный бульон (МПБ) с 3 % пептона или пептонную воду. Среду разливают в маленькие пробирки с ватными пробками чуть больше, чем наполовину их объёма, добавляют немного почвы для заражения, закрепляют две индикаторные бумажки: розовую лакмусовую – индикатор на аммиак, а полоску фильтровальной бумажки, пропитанную в растворе уксуснокислого свинца – индикатор на сероводород (бумажки не должны касаться среды). Пробирки закрывают ватными пробками, плотно оборачивают пробки пергаментной бумагой, подписывают и помещают в термостат при температуре 25-30 ºС.

Элективные условия для аммонификации:

1) обилие в среде белковых форм азота;

2) высокий столбик среды позволяет развиваться на поверхности среды аэробам, в середине толщи среды – факультативным анаэробам, а на дне пробирки - облигатным анаэробам.

Результаты опыта. Через неделю делают выводы о продуктах, выделяемых при аммонификации белковых веществ и микроскопируют возбудителей этого процесса.

Определение аммиака и сероводорода.

Посинение розовой лакмусовой бумажки свидетельствует о выделении аммиака.

Почернение фильтровальной бумажки, смоченной уксуснокислым свинцом, говорит о выделении сероводорода, а если она еще и покроется серебристым налетом, значит наряду с сероводородом выделяются и меркаптаны.

Отмечают в опытных пробирках изменение цвета индикаторных бумажек и делают выводы о выделяющихся в результате аммонификации белковых веществ газах.

Микроскопирование. Готовят препарат-мазок, для этого бактериальную петлю опускают почти до самого дна пробирки и удерживают там несколько секунд, потом медленно поднимают петлю, задерживаясь посередине толщи среды еще на несколько секунд, а затем извлекают из пробирки и делают мазок, чтобы в готовом препарате можно было найти разных по отношению к кислороду микробов. Фиксируют в пламени, красят кристаллвиолетом (30-60 с) и рассматривают с иммерсией.

Белки могут разлагаться бактериями, актиномицетами, грибами. Среди аммонифицирующих (гнилостных) бактерий встречается большое разнообразие, различных по форме и по-разному относящихся к кислороду. Среди них есть легко узнаваемые по ряду морфологических признаков:

Аэробы. Bacillus mycoides – грибовидная бацилла – небольшие палочки (0,8×5-7 мкм), подвижные, спорообразование центральное, бациллярное, клетки соединены в длинные цепочки. (На твёрдых питательных средах дают характерные грибовидные колонии).

Bacillus mesentericus – картофельная палочка – крупные палочки (0,6×8-10 мкм) с бациллярным спорообразованием, с закругленными концами, одиночные или соединенные в цепочки.

Факультативные анаэробы. Proteus vulgaris - протей обыкновенный – тонкие, подвижные, неспоровые палочки различной длины (0,3×4-6 и более мкм). Из-за своей полиморфности названы в честь мифического бога Протея.

Escherichia coli – кишечная палочка – подвижные, мелкие, короткие, неспоровые палочки (0,5×2-4 мкм).

Облигатные анаэробы. Clostridium putrificus – гнилостная палочка – подвижные палочки с плектридиальным расположением споры (спора на конце клетки, которая имеет вид барабанной палочки).

Clostridium sporogenes – спорогенная палочка –палочки округлой формы (5-6 мкм), подвижные, спорообразование клостридиальное (спора занимает почти всю центральную часть клетки, имеющий вид лимона).

Характеристика аммонифицирующих (гнилостных) бактерий: среди них есть грамположительные и грамотрицательные формы, они представляют собой палочки, подвижные, споровые и неспоровые, аэробы, факультативные анаэробы и облигагатные анаэробы, гетеротрофы.

Зарисовывают найденные аммонифицирующие бактерии в тетради и подписывают.

Материалы и оборудование: питательная среда (МПБ с 3 % пептона или ПВ), разлитая в малые пробирки с ватными пробками, фарфоровые чашки с почвой и ложечками, чашки Петри с розовой лакмусовой бумагой и полосками фильтровальной бумаги, пропитанные раствором уксуснокислого свинца Pb(CH₃COO)₂, кристаллвиолет.

Работа 21. Нитрификация

Нитрификация – это процесс окисления аммиака (или аммиачных форм азота) сначала в азотистую кислоту (или нитриты), а затем в азотную кислоту (или нитраты). Этот процесс идет в две фазы:

I фаза – 2NH₃ + 3O₂ = 2HNO₂ + 2H₂O + 275 кДж,

II фаза – 2HNO₂ + O₂ = 2HNO₃ + 87 кДж.

Постановка опыта. Для исследования процесса нитрификации готовят питательную среду Виноградского по табл. 3.

Таблица 3