Работа №10. Обессоливание белкового раствора методом гель-фильтрации
Низкомолекулярные вещества из белкового раствора можно удалить достаточно быстро и полно с помощью гель-фильтрации. Принцип, лежащий в основе этого метода, весьма прост. Хроматографическую колонку заполняют гелем, набухшим в воде или буферном растворе. Разделение веществ основано на различии размеров молекул. Крупные молекулы не проникают в поры гранул геля и выходят из колонки в первую очередь, а небольшие молекулы через поры попадают в гранулы, вследствие чего задерживаются на колонке и движутся с меньшей скоростью (рис. 2, а). Метод гель-фильтрации Рис. 2. Разделение веществ методом гель-фильтрации (схема). часто называют разделением веществ по принципу молекулярного сита. Три стадии такого разделения показаны на рис. 2 (б, в, г). Свойствами молекулярного сита обладают многие пористые материалы. Наиболее часто для этой цели применяют органические полимеры с трехмерной сетчатой структурой: например, гели полисахарида декстрана (коммерческое название «сефадексы»). При изготовлении сефадексов полисахаридные цепи декстрана соединяются поперечными сшивками. Существует несколько типов сефадексов, различающихся как размером и количеством пор, так и величиной гранул. Это позволяет применять их для разделения веществ с молекулами разного размера. Благодаря высокому содержанию гидроксильных групп гранулы сефадекса легко набухают, образуя гель. Чем выше скорость набухания геля, тем больше номер сефадекса. Для освобождения белковых растворов от солей обычно используют сефадекс марки G-25. Материал для исследования. Яичный альбумин, 1 % раствор. Реактивы.Биуретовый реактив; хромат калия К2СЮ4, сухой порошок; гель сефадекса G-25; дистиллированная вода. Оборудование.Колонка с краном размером 1 х 25 см; делительные воронки или склянки с тубусом; воронки, химические стаканы; стеклянные палочки; штативы с пробирками; пипетки на 1 мл; стеклянная вата. 1. Приготовление геля: 4 г порошка сефадекса G-25 суспендируют в 200 мл дистиллированной воды в химическом стакане. После отстаивания основной массы порошка воду с мелкими частицами осторожно сливают. Эту процедуру повторяют до тех пор, пока надосадочная жидкость не станет прозрачной. При комнатной температуре весь процесс полного набухания геля занимает 3 ч. Если нагреть суспензию на водяной бане до температуры 100 °С, то это время сокращается до 1 ч. 2. Подготовка колонки: в колонку с закрытым краном наливают небольшое количество дистиллированной воды. На дно колонки помещают кусочек стеклянной ваты, при этом необходимо удалить пузырьки воздуха. Затем в колонку через воронку вливают густую суспензию геля сефадекса. Ход работы. 1. Нанесение раствора белка. Колонка приготовлена заранее. Перед нанесением раствора открывают кран на колонке и наблюдают за уменьшением столбика воды над слоем сефадекса. Как только над поверхностью геля остается слой жидкости толщиной 1—2 мм, кран закрывают и при помощи пипетки аккуратно наносят на гель 1 мл белкового раствора, в который предварительно добавляют 5 мг К2Сг04. Кран открывают и следят за проникновением раствора в гель. Снова закрывают кран, стенки колонки ополаскивают 1 мл дистиллированной воды при помощи пипетки, открывают кран и позволяют жидкости впитаться в гель. Затем кран закрывают и, стараясь не взмучивать гель, добавляют из пипетки аккуратно по стенке 4—6 мл дистиллированной воды. 2. Сбор фракций. В 14 пробирок отмеривают по 1 мл биуретового реактива. К колонке присоединяют делительную воронку с водой и открывают кран. Собирают фракции с колонки по 20 капель (1 мл) в пробирки, содержащие биуретовый реактив. Наблюдают изменение окраски на фиолетовую в порциях элюата, содержащего белок. Выход хромата калия отмечают по появлению желтого окрашивания раствора в очередной пробирке. Гель в колонке отмывают водой до полного удаления К2Сг04. После этого колонка снова готова к употреблению. Оформление работы.Описывают принцип метода; результаты опыта заносят в таблицу. Форма записи
Отсутствие окраски обозначают знаком минус (—), появление окраски — знаком плюс (+), а несколько знаков плюс указывает на значительную интенсивность окраски. Выводы, полученные при анализе результатов опыта, также заносят в протокол.
Популярное: Как выбрать специалиста по управлению гостиницей: Понятно, что управление гостиницей невозможно без специальных знаний. Соответственно, важна квалификация... Как построить свою речь (словесное оформление):
При подготовке публичного выступления перед оратором возникает вопрос, как лучше словесно оформить свою... Личность ребенка как объект и субъект в образовательной технологии: В настоящее время в России идет становление новой системы образования, ориентированного на вхождение... ©2015-2024 megaobuchalka.ru Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. (1953)
|
Почему 1285321 студент выбрали МегаОбучалку... Система поиска информации Мобильная версия сайта Удобная навигация Нет шокирующей рекламы |