Цветовой указатель результатов биохимических реакций

3.5. Определение спор сульфитредуцирующих клостридий

методом мембранной фильтрации

    Сульфитредуцирующие клостридии не всегда встречаются в фекалиях, они успешно размножаются в почве, донных отложениях, в воде. В этой связи их санитарно-показательная значимость ограничена. Однако споры клостридий обладают высокой устойчивостью к обеззараживающим реагентам и способны к существованию в воде значительно дольше других индикаторов. Обнаружение спор сульфитредуцирующих клостридий в питьевой воде указывает на ее недостаточную очистку, в частности, на дефекты при фильтрации.

Сульфитредуцирующие клостридии, преимущественно Clostridium perfringens – спорообразующие анаэробные палочковидные микроорганизмы, восстанавливающие сульфит натрия на железо-сульфитном агаре при температуре 44°С в течение 24 часов.

    Метод основан на фильтрации исследуемого объёма воды через мембранные фильтры, выращивании посевов в железо-сульфитном агаре в условиях, приближённых к анаэробным, и подсчёте числа чёрных колоний.

Ход анализа.

    Перед фильтрацией пробу воды в количестве 20 мл прогревают на водяной бане в пробирках при температуре (75±5)°С в течение 15 минут для исключения вегетативных форм. Затем производят посев на железо-сульфитный агар.

    Железо-сульфитный агар.

    Основная среда. К 1000 мл стерильного расплавленного МПА добавляют 10 г глюкозы, нагревают до растворения, разливают в пробирки или во флаконы и автоклавируют при 112°С 12 минут.

    20% раствор сульфита натрия (Na₂SO₃) и 8% раствор сульфата железа (FeSO₄) или хлорида железа (FeCl₂) готовят непосредственно перед употреблением в стерильной посуде на стерильной дистиллированной воде. Раствор сульфита натрия нагревают до полного растворения.

    Перед выполнением анализа в 100 мл расплавленной основной среды вносят 5 мл 20% раствора сульфита натрия (Na₂SO₃), перемешивают, затем вносят 1 мл 8% раствора сульфата железа (FeSO₄), перемешивают и разливают с соблюдением правил стерильности в стерильные пробирки высотой 12-15 см – для работы методом мембранной фильтрации, или во флаконы – для работы методом прямого посева.

    Существует два варианта определения спор сульфитредуцирующих клостридий методом мембранной фильтрации.

    Вариант 1 – определение в пробирках.

    Перед посевом пробирки с железо-сульфитным агаром расплавляют на водяной бане (не кипятить!).

    После фильтрации установленного объёма воды (20 мл), предварительно прогретой на водяной бане, мембранный фильтр стерильным пинцетом берут за два противоположных края и, согнутым в виде трубочки, помещают в пробирку с горячим агаром. Сторона фильтра с осевшими бактериями обращена внутрь. При этом фильтр распрямляется и располагается по стенке пробирки. Пробирку с агаром и фильтром быстро охлаждают для создания анаэробных условий, помещая в ёмкость с холодной водой. Посевы инкубируют при 44°С в течение 24 часов.

    Вариант 2 – определение в чашках Петри.

    Чашки Петри заливают тонким слоем железо-сульфитного агара. После фильтрации фильтр помещают фильтрующей поверхностью вниз на застывшую питательную среду так, чтобы под фильтром не было пузырьков воздуха. Затем заливают расплавленным железо-сульфитным агаром до верхнего края чашки, чтобы крышка плотно прилегала к среде для создания анаэробных условий. Посевы инкубируют при 44°С в течение 24 часов.

Учёт результатов.

    Учёту подлежат только те посевы, где получены изолированные колонии, как выросшие на фильтрах, так и в толще среды. Подсчитывают чёрные колонии.

3.6. Определение спор сульфитредуцирующих клостридий

методом прямого посева

    Метод основан на посеве установленного объема воды в пробирки с железо-сульфитным агаром, инкубации посевов при температуре 44°С в течение 24 часов и подсчёте чёрных колоний.

    Из каждой пробы делают посев воды, предварительно прогретой на водяной бане в пробирках при температуре (75±5)°С в течение 15 минут, в железо-сульфитный агар.

    С этой целью в стерильные пробирки вносят по 5 мл воды, заливают горячим 75-80°С железо-сульфитным агаром в количестве, превышающем объём воды в 2 раза. Среду заливают по стенке пробирки, избегая образования пузырьков воздуха. После этого пробирку быстро охлаждают, помещая её в ёмкость с холодной водой для создания анаэробных условий. Посевы инкубируют при 44°С в течение 24 часов.

Учет результатов.

    Учёту подлежат те посевы, где получены изолированные черные колонии, выросшие в толще среды. Результат выражают числом КОЕ спор сульфитредуцирующих клостридий в 20 см³ воды.

3.7. Определение колифагов

    Не только бактериальное загрязнение питьевой воды представляет угрозу здоровью населения. Более опасным является контаминация водопроводной воды патогенными вирусами, более устойчивыми, по сравнению с бактериями, к воздействию физических и химических факторов, а также к обеззараживающим агентам (хлор, озон). Попадая с недостаточно очищенными хозяйственно-бытовыми сточными водами в водоёмы вирусы, в силу своей высокой устойчивости, свободно распространяются в водной среде и через очистные сооружения водопроводных станций проникают в воду распределительной сети. Это свидетельствует о том, что бактериальные индикаторы не могут служить адекватными показателями надежности обработки питьевой воды в отношении вирусов. Адекватными индикаторами вирусного загрязнения являются колифаги. Они не патогенны и безопасны для человека, имеют единый с энтеровирусами источник поступлений в окружающую среду; по размерам, строению и физико-химическим свойствам, по устойчивости к факторам окружающей среды и дезинфектантам наиболее близки к вирусам. Колифаги сами являются бактериальными вирусами, способными лизировать кишечную палочку, обнаруживаются во всех объектах, где встречаются вирусы. Уровни содержания колифагов и энтеровирусов в питьевой воде изменяются одинаково по сезонам года. Колифаги являются индикаторами очистки питьевой воды в отношении энтеровирусов.

Колифаги – бактериальные вирусы, способные лизировать кишечную палочку и формировать зоны лизиса бактериального газона (бляшки) через 18-20 часов при температуре 37°С на питательном агаре.

Метод предназначен для проведения текущего контроля качества питьевой воды.

Ход анализа.

     Накануне проведения анализа необходимо сделать посев E. coli на косяк с питательным агаром.

    Перед проведением анализа сделать смыв бактерий с этого косяка 5 мл стерильной водопроводной воды. По стандарту мутности приготовить взвесь E. coli в концентрации 10⁹ бактериальных клеток в 1 мл. Расплавить и остудить до 45°С 2% питательный агар. Исследуемую воду (100 мл) внести в 5 стерильных чашек Петри по 20 мл в каждую. В питательный агар добавить смыв E. coli из расчета 1,5 мл смыва бактерий (в концентрации 10⁹ клеток в 1 мл) на 150 мл агара и осторожно перемешать. Полученной смесью по 30 мл залить сначала пустую чашку Петри (контроль газона E. coli), а затем все чашки, содержащие исследуемую воду. Содержимое чашек осторожно перемешать. Чашки оставить на 30 минут при комнатной температуре для застывания, затем дном вверх поместить в термостат для инкубирования при температуре 37°С.

    Если агар застыл не полностью, чашки Петри следует инкубировать в термостате, не переворачивая.

Учёт результатов.

    Учёт результатов проводят путём подсчета и суммирования бляшек, выросших на 5 чашках Петри. Результаты выражают в бляшкообразующих единицах (БОЕ) на 100 мл пробы воды. В контрольной чашке бляшки колифагов должны отсутствовать.

    Накопленный к настоящему времени материал свидетельствует о возможности передачи лямблиоза и криптоспоридиоза через централизованную систему водоснабжения. Цисты лямблий и ооцисты криптоспоридий обладают более выраженной, по сравнению с бактериями и вирусами, резистентностью к действию дезинфицирующих агентов, используемых на водопроводных станциях. Передача этих возбудителей в большинстве случаев осуществляется через питьевую воду, удовлетворяющую стандартам по колиформным бактериям. В отношении паразитарных возбудителей заболеваний человека индикаторные организмы не выявлены, поэтому предусматривается непосредственное определение цист в воде.