Определение условно-патогенных микроорганизмов

8.1. Метод определения стафилококков

(ГОСТ 10444.2 - 94)

Из навески исследуемого продукта готовят ряд десятикратных разведений. При анализе пищевых продуктов с большим содержанием NaCI проводят посев продукта или его разведений на сахарный бульон, во всех других случаях – на солевой бульон. Посевы инкубируют в течение 18-24 часов. Для подтверждения принадлежности микроорганизмов к стафилококкам делают посевы на поверхность селективно-диагностической среды (желточно-солевой агар). Посевы инкубируют при температуре 37°С в течение 24-48 часов, после чего просматривают и отмечают рост характерных колоний. На желточно-солевом агаре колонии St. aureus окружены зоной лецитиназной активности. Для подтверждения принадлежности колоний к St. aureus отбирают не менее 5 колоний и пересевают на поверхность скошенного мясо-пептонного агара. Посевы инкубируют при температуре 37°С в течение 24 часов. У выросших микроорганизмов определяют отношение к окраске по Граму, способность коагулировать плазму крови кролика, образовывать каталазу и ферментировать маннит в анаэробных условиях.

Желточно-солевой агар.

В расплавленный и остуженный до 60°С МПА pH 7,2 с 10% раствор хлористого натрия прибавляют 10-20 процентов желточной взвеси в соотношении 3:1. Предварительно желток асептически извлекают из яйца, взбалтывают с 200 мл физиологического раствора. Затем агар тщательно смешивают с желточной взвесью и разливают в чашки Петри.

Определение способности стафилококков коагулировать

Плазму крови кролика

К плазме крови кролика, разлитой по пробиркам, добавляют по одной петле испытуемых культур, оставляя одну пробирку с разведённой плазмой в качестве контроля незасеянной. Внесённую культуру размешивают и помещают в термостат при температуре 37°С. Если через 6 ч коагуляции не произошло, то пробирки оставляют при температуре 30°С на 24 ч. Если и через 24 ч плазма не скоагулировала, то испытуемую культуру стафилококка относят к коагулазоотрицательной.

Реакцию считают положительной, если:

1. В плазме образуется небольшой компактный сгусток (++);

2. Образуется большой уплотненный сгусток (+++);

3. Плазма вся скоагулировала, сгусток не меняет своего положения при перевёртывании пробирки (++++).

Ферментация маннита в анаэробных условиях

Среду с маннитом разливают в пробирки по 10 мл, стерилизуют. Перед посевом среду освобождают от воздуха, для чего пробирки кипятят в водяной бане при температуре 100°С 10 мин., затем быстро охлаждают в ледяной воде и немедленно производят посев уколом. Сверху заливают расплавленным 2% водным агаром слоем 2-3 см, чтобы исключить попадание воздуха. Посевы термостатируют при температуре 37°С в течение 4 суток. Результаты считают положительными, когда нижние и верхние части среды чётко изменяют цвет с зелёного на синий. В этом случае микроорганизмы идентифицируются как Staphylococcus aureus (табл. 4).

Таблица 4

Идентификация стафилококков

(Медицинская микробиология, 1999)

(+) – реакция есть

(–) – реакции нет

8.4. Метод определения бактерии рода Proteus (ГОСТ 28560 - 90)

Для получения чистой культуры производят посев исследуемого материала из основного разведения (10% взвесь) по 0,5 мл в конденсат свежескошенного агара по методу Шукевича и термостатируют 20-24 часа. Если наблюдается ползущий нежный вуалеобразный рост, то с верхнего края выросшей культуры готовят препарат, окрашивают по Граму и микроскопируют. При наличии грамотрицательных полиморфных палочек дают заключение о наличии бактерий рода Proteus в исследуемом продукте.

Для выявления О-формы протея делают посев на поверхности питательной среды Плоскирева. 0,5 мл исходной взвеси тщательно втирают шпателем в поверхность среды, инкубируют при температуре 37°С 18-24 ч. Для получения Н-формы одну петлю суточной культуры протея наносят на поверхность свежеприготовленного 1,5% мясо-пептонного агара в центре чашки. Через 18 часов наблюдается феномен «роения» – поверхность покрывается тонким слоем налета с голубоватым оттенком.

К роду Proteus относятся 2 вида (Proteus vulgaris и Proteus mirabilis) (табл. 5).

Таблица 5

Дифференциация видов рода Proteus

(Медицинская микробиология, 1999)

(+) – ферментация

(–) – отсутствие ферментации

(±) – ферментация / отсутствие ферментации

Присутствие в пищевых продуктах микроорганизмов этой группы – признак начала гнилостных изменений. Указанные бактерии также могут быть причиной пищевых токсикоинфекций.

8.5. Метод выявления сульфитредуцирующих клостридий

(ГОСТ 10444.9 – 88)

Сульфитредуцирующие клостридии выявляют путем посева определенного количества продукта (1 г или 1 см³) в среды, содержащие сульфит железа (среда Вильсона-Блер). Пробы высевают глубинным методом параллельно в две чашки Петри. Посевы помещают в термостат при температуре 44⁰С на 24-48 часов.

При наличии в исследуемом объекте клостридий в толще среды наблюдаются черные колонии. Черное окрашивание появляется за счет восстановления бактериями сульфита натрия до сульфата натрия, который, взаимодействуя с хлоридом железа, приводит к образования черного сульфида железа (FeS).

Среда Вильсона-Блер (железосульфитный агар).

К 100 мл сахарного (с 1% глюкозы) расплавленного и охлаждённого до 60°С МПА добавляют 5 мл 20% раствора сульфита натрия (Na₂SO₃) и 1 мл 8% раствора хлорида железа (FeCl₂), которые готовят непосредственно перед использованием на стерильной дистиллированной воде.