Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий

методом мембранной фильтрации

К общим колиформным бактериям относятся грамотрицательные не образующие спор палочки, не обладающие оксидазной активностью, ферментирующие лактозу или маннит с образованием альдегида, кислоты и газа при температуре 37°С в течение 24-48 часов. Общие колиформы представляют широкую группу микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae, включающую наряду с E. coli микроорганизмы родов Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, которые также могут находиться в кишечнике. Колиформный тест применяется как индикатор очистки и санитарного состояния водоснабжения. Обнаружение общих колиформных бактерий свидетельствует о недостаточной очистке воды.

    Термотолерантные колиформные бактерии обладают всеми признаками общих колиформных бактерий, которые также способны ферментировать лактозу до кислоты, альдегида и газа, но при температуре 44°С в течение 24 часов. В группу термотолерантных колиформных бактерий входит род Escherichia, а также отдельные виды родов Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter. Термотолерантные колиформные бактерии рассматриваются как показатели фекального загрязнения.

Метод основан на фильтрации установленного объёма воды через мембранные фильтры, выращивании посевов на селективной питательной среде с лактозой и последующей идентификации колоний по культуральным и биохимическим свойствам.

    Для качественного анализа используют воду в объёме 100 мл. Этот объём воды фильтруют через нитроцеллюлозный мембранный фильтр. Для этих целей используют фильтры с диаметром пор 0,45 мкм. Перед фильтрованием фильтр помещают в дистиллированную воду и кипятят 15-20 минут. Обработанный таким образом фильтр помещают блестящей поверхностью вниз на сетку фильтра Зейтца, вставленного в колбу Бунзена. В воронку наливают исследуемый объём воды и фильтруют с помощью водоструйного насоса или аппарата Комовского. После фильтрования фильтр переносят стерильным пинцетом на чашку Петри со средой Эндо. Чашки с фильтрами помещают на сутки в термостат дном вверх и инкубируют посевы при температуре 37°С (определение общих колиформных бактерий).

    Для определения термотолерантных бактерий посев инкубируют при температуре 44°С в течение 24 часов.

Учёт результатов.

    Результат считается отрицательным, если на фильтрах нет роста колоний или отмечен рост пленчатых, губчатых, плесневых, прозрачных и расплывчатых колоний. При наличии типичных лактозоположительных колоний, дающих отпечаток на обратной стороне мембранного фильтра и среде – темно-красных, красных с металлическим блеском и без него, выпуклых с красным центром и других оттенков, а также лактозоотрицательных – розовых без отпечатков, подсчитывают число колоний каждого типа.

    Для идентификации отбирают колонии каждого вида, делают их посев на скошенный МПА или на чашки секторами, инкубируют при температуре 37°С 16-18 часов.

    Все дальнейшие биохимические тесты проводят только с чистыми культурами.

    В качестве подтверждающих тестов используют оксидазный тест и тест образования кислоты и газа при ферментации лактозы или маннита.

Тест на оксидазную активность проводят с помощью системы индикаторной бумажной (СИБ). СИБ для определения оксидазной активности представляет собой хроматографическую бумагу, пропитанную растворами диметил-парафенилендиамина и α-нафтола. Цвет индикаторных полосок серовато-фиолетовый.

    Механизм реакции: оксидаза, продуцируемая микроорганизмами, обуславливает взаимодействие между диметил-парафенилендиамином и

α-нафтолом, при этом образуется индофенол синий, окрашивающий культуру в синий цвет.

    Постановка оксидазного теста: часть изолированной колонии изучаемой культуры петлей наносят на пропитанную реактивом фильтровальную бумагу, помещенную в чашку Петри. Если в течение 1 мин. появляется фиолетово-коричневое окрашивание, культура считается оксидазоположительной и дальнейшему изучению не подлежит. Если реакция на оксидазу отрицательная (цвет на месте нанесения культуры не меняется), культура подлежит дальнейшему исследованию. Оксидазоотрицательные колонии засевают в пробирки с полужидкой лактозной средой.

    Полужидкая среда с лактозой или маннитом (глюкозой): в 1 л дистиллированной воды растворяют 10 г пептона, 5 г NaCl, 4-5 г агар-агара, доводят до кипения, устанавливают рН 7,2-7,4, добавляют 1 мл 1,6% спиртового раствора бромтимолового синего. Стерилизуют при 120°С 20 минут. В расплавленную среду вносят 5 г лактозы или маннита (глюкозы), нагревают до кипения, разливают в стерильные пробирки на высоту 3-5 см и стерилизуют при 112°С 10 минут. Правильно приготовленная среда – зеленого цвета с синеватым оттенком (цвет бутылочного стекла).

    Посев производят уколом до дна пробирки. При образовании кислоты цвет среды изменяется в жёлтый, при газообразовании газ скапливается или по уколу, или на поверхности, или в толще среды появляются разрывы.

    Для определения общих колиформных бактерий посев инкубируют при 37°С, для определения термотолерантных колиформных бактерий посев инкубируют при 44°С в течение 24 часов.

    Грамотрицательные колонии учитывают как общие колиформные бактерии при отрицательном оксидазном тесте, ферментации лактозы при температуре 37°С с образованием кислоты и газа. Грамотрицательные колонии учитывают как термотолерантные колиформные бактерии при отрицательном оксидазном тесте и ферментации лактозы при температуре 44°С с образованием кислоты и газа.

3.3. Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий

титрационным методом

    Титрационный метод может быть использован:

– при отсутствии материалов и оборудования, необходимых для выполнения анализа методом мембранной фильтрации;

– при анализе воды с большим содержанием взвешенных веществ;

– в случае преобладания в воде посторонней микрофлоры, препятствующей получению на фильтрах изолированных колоний общих колиформных бактерий.

    Метод основан на накоплении бактерий после посева установленного объёма воды в жидкую питательную среду, с последующим пересевом на селективную плотную питательную среду с лактозой и идентификации колоний по культуральным и биохимическим тестам.

    Для качественного анализа засевают 100 мл воды в 10 мл концентрированной лактозо-пептонной среды (ЛПС – среда накопления). При исследованиях воды с целью количественного определения общих колиформных бактерий производят посев по 10 мл и по 1 мл. Посев 1 мл пробы проводят в 10 мл среды обычной концентрации.

    Лактозо-пептонная среда (ЛПС).

    В состав ЛПС входят 10 г пептона, 5 г NaCl, 5 г лактозы (глюкозы), которые растворяют при нагревании в 1 л дистиллированной воды. После растворения всех ингредиентов устанавливают рН 7,4-7,6 и разливают по 10 мл в пробки, стерилизуют при 112°С 10 мин.

    Для приготовления концентрированной лактозо-пептонной среды все ингредиенты, кроме воды, увеличивают в 10 раз.

    Посевы инкубируют при температуре 37°С в течение 24-28 часов. Если после инкубации отмечено наличие роста (помутнение) и образование газа или только помутнение, то производят высев на среду Эндо для получения изолированных колоний. Посевы на среде Эндо инкубируют при температуре 37°С в течение 18-20 часов. Колиформные бактерии образуют на чашках Петри темно-красные или красные колонии с металлическим блеском и без него. Затем проводят подтверждающие тесты на оксидазную активность и образование кислоты и газа при ферментации лактозы (см. Определение общих и термотолерантных бактерий методом мембранной фильтрации).

Учёт результатов.

    Результат считается положительный на присутствие общих колиформных бактерий в данном объёме пробы при образовании помутнения и газа в среде накопления и росте на среде Эндо типичных для лактозоположительных бактерий колоний, а также при обнаружении кислоты и газа на среде с лактозой (при 37°С).

    Для определения термотолерантных колиформных бактерий работают со средой Эндо, где выросли типичные лактозоположительные колонии и отмечены помутнение и газообразование в среде накопления (лактозо-пептонная среда). Делают посев изолированных колоний в пробирки с лактозной средой, которую перед посевом нагревают до 44°С. После посева пробирки помещают в термостат и инкубируют при 44°С в течение 24 часов.

    Ответ считается положительным при наличии роста и образовании газа в среде накопления, росте на среде Эндо и при обнаружении кислоты и газа на среде с лактозой (при 44°С).

3.4. Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий

с помощью пластины биохимической для дифференциации энтеробактерий (ПБДЭ)

    Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий можно проводить с помощью одноразовой диагностической тест-системы для идентификации энтеробактерий (ПБДЭ).

    ПБДЭ позволяет определить следующие биохимические свойства: утилизацию цитрата натрия, как в присутствии сахара (модификация цитратной среды Христенсена), так и без него (модификация цитратной среды Симмонса), малоната натрия, глюкозы, лактозы, маннита, сахарозы, инозита, сорбита, арабинозы, мальтозы, образование индола, сероводорода, ацетилметилкарбинола (реакция Фогес-Проскауэра), наличие уреазы, β-галактозидазы, декарбоксилаз орнитина и лизина, дегидролазы аргенина, дезаминазы фенилаланина.

    ПБДЭ представляет собой панель с 20 конусообразными лунками, на дно которых нанесены соответствующие субстраты с индикатором, стабилизированные поливиниловым спиртом. Панель закрывается крышкой. Панель и крышка изготовлены из полистирола.

    Субстраты с индикаторами вносят в лунки в жидком виде, затем высушивают и стерилизуют.

    ПБДЭ предназначена для определения ферментативной активности микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae, выделяемых в ходе бактериологического исследования, и идентификации представителей данного семейства до вида.

    С этой целью готовят микробную суспензию, равную 10 единицам стандартного образца мутности из колоний, выращенных в течение 18-24 часов при 37⁰С, подозрительных на энтеробактерии (темно-красные, красные колонии с металлическим блеском и без него). При отсутствии стандартного образца в 4 мл стерильного фосфатно-солевого буферного раствора (или физраствора, рН 6,0) вносят исследуемую культуру (2-3 петли) до образования видимой мутности. Затем раскапывают мерной пипеткой по 0,15 мл микробной суспензии в каждую лунку, кроме теста на сероводород (№ 11), куда вносится только 1 капля (0,05 мл) суспензии. Лунку с тестом на сероводород заливают 0,1 мл растопленного и охлажденного до 40°С полужидкого 0,6% агара. Для создания анаэробных условий лунки с тестами заливают сверху стерильным вазелиновым маслом (1-2 капли): лизин (№ 4), аргинин (№ 5), орнитин (№ 6), уреаза (№ 10) и H₂S (№ 11). Закрывают крышку планшета и инкубируют 18-24 часа при 37°С (для общих колиформных бактерий) и при 44°С (для определения термотолерантных колиформных бактерий).

    После окончания инкубации в лунки с тестами на фенилаланин (№ 7) добавляют 1 каплю 10% FeCl₃, на ацетилметилкарбинол (№ 9) – 1 каплю 6% α-нафтола и затем 1 каплю40 % КОН, на индол (№ 8) – 1-3 капли реактива Эрлиха.

    Учет результатов производится в соответствии с цветовым указателем, приложенным к ПБДЭ (табл. 3).

    Идентификацию культур микроорганизмов осуществляют с использованием таблицы биохимических свойств энтеробактерий и диагностического «ключа».

    ПБДЭ обезвреживают автоклавированием или помещением в дезраствор на 18-24 часа.

Таблица 3