Определение диастазного числа

Диастазное число характеризует активность амилолитических ферментов меда.

Метод основан на колориметрическом определении количества субстрата, расщепленного в условиях проведения ферментативной реакции, и последующем вычислении диастазного числа.

Диастазное число выражают количеством кубических сантиметров раствора крахмала массовой долей 1%, которое разлагается за 1 ч амилолитическими ферментами, содержащимися в 1 г безводного вещества меда. 1 см³ раствора крахмала соответствует 1 единице активности.

Аппаратура, материалы, реактивы. Фотоэлектроколориметр; рН-мет; электрод измерительный стеклянный; баня-термостат водяная на 20 и 40°С; пробирки стеклянные диаметром 20 мм и высотой 200 мм; бюретка вместимостью 25 см³ с ценой деления 0,1 см³; пипетки вместимостью 1,2 и 5 см³; колбы мерные вместимостью 50 см³; секундомер; крахмал растворимый для йодометрии, раствор массовой долей 0,25%; кислота уксусная ледяная плотностью 1,07 г/см³, раствор концентрации 0,2 моль/дм³; ацетат натрия трехводный, раствор концентрации 0,2 моль/дм³; хлорид натрия, раствор концентрации 0,1 моль/дм³; 2,4-динитрофенол; йод, раствор концентрации 0,25 моль/дм³; раствор буферный стандартный с рН близким к 5,0 для проверки стеклянного электрода; вода дистиллированная.

Подготовка к испытанию. Ацетатный буферный раствор концентрации 0,2 моль/дал³ с рН 5,0 приготовляют, смешивая одну объемную часть раствора уксусной кислоты и три объемных части раствора ацетата натрия. В полученном буферном растворе растворяют 2,4-динитрофоенол с таким расчетом, чтобы его концентрация в комбинированном реактиве составила 0,05%. Проверяют рН раствора потенциометричеки и в случае отклонении от рН 5,0 его корректируют, добавляя раствор уксусной кислоты концентрации 0,2 моль/дм³ или раствор ацетата натрия концентрации 0,2 моль/дм³.

Комбинированный реактив готовят из восьми объемных частей раствора крахмала, пяти объемных частей буферного раствора с 2,4 динитрофенолом и одной объемной части раствора хлорида натрия. При приготовлении комбинированного реактива в количестве, равном или большем1 дм³ объем соответствующих растворов отмеривают с точностью до 0,5 см³. Полученную смесь тщательно встряхивают. Реактивы хранят при комнатной температуре не более 3 мес.

Раствор меда. 5 г меда, взвешенного с точностью до 0,01 г, растворяют в дистиллированной, воде в мерной колбе вместимостью 50 см³. 1 см³ такого раствора содержит 0,1 г меда.

Раствор крахмала. 0,25 г крахмала, взвешенного с точностью до 0,001 г, размешивают в стаканчике вместимостью 50 см³ с 10-20 см³ дистиллированной воды и количественно переносят в коническую колбу, где не сильно кипит 60-90 см³ дистиллированной воды. Кипение продолжают 2-3 мин. Колбу охлаждают до 20°С, содержимое количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят до метки.

Проведение испытания. В сухую пробирку отмеривают из бюретки 14 см³ комбинированного реактива. Пробирку закрывают резиновой пробкой и помещают на 10 мин в водяную баню с температурой 40°С. Затем в пробирку вносят пипеткой 1 см³ раствора меда. Содержимое перемешивают пятикратным перевертыванием и пробирку вновь помещают на водяную баню, одновременно включая секундомер. Пробирку выдерживает на водяной бане в течение 15 мин при температуре (40±0,02)°С.

Пипеткой отбирают 2 см³ реакционной смеси, которую вносят при перемешивании в мерную колбу вместимостью 50 см³, содержащую 40 см³ воды и 1 см³ раствора йода, имеющих температуру 20°С. Раствор доводят водой до метки. Колбу закрывают пробкой, содержимое хорошо перемешивают и выдерживают на водяной бане при 20°С в течение 10 мин.

Одновременно проводят контрольный опыт, заменяя раствор меда дистиллированной водой.

Оптическую плотность измеряют на фотоэлектроколориметре против воды при светофильтре с длиной волны 582 или 590 нм, используя кювету с рабочей длиной 10 мм. Значения оптической плотности испытуемого раствора (Д_ИСП) и контрольного опыта (Д) записывают с точностью 0,001.

Обработка результатов. Диастазное число меда (X, ед.Готе) в пересчете на 1 г безводного вещества вычисляют по .формуле

Х = (98)

где Д_К - оптическая плотность контрольного раствора;

Д_исп - оптическая плотность испытуемого раствора;

80 - коэффициент пересчета;

ω - массовая доля воды в меде, %.

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Допустимые расхождения между результатами параллельных определений не должны превышать 0,5 ед.Готе в интервале величин менее 10 ед.