Активация, дифференцировка и селекция лимфоцитов

 

1) Сигнальные белки, входящие в комплексы BCR и TCR. ITAM и ITIM мотивы, SH2 домен.

2) Корецепторы BCR и TCR.

3) Основные рецепторы сигналов костимуляции на В и Т клетках.

Рецептор	BCR	TCR
Сигнальные белки, входящие в комплексы (они нужны, чтобы передавать сигнал внутрь клетки, тк у самих рецепторов нет внутриклеточных частей)	Igα, Igβ (на внутриклеточных частях есть сигнальные участки - ITAM)	CD3 (имеют 2 субъединицы: гамма или дельта и эпсилон), еще есть отдельная дзета - без внеклеточной части. На внутриклеточных частях есть сигнальные участки - ITAM
Корецепторы	CD21, CD19, CD18 - узнают результат работы комплемента (подтверждение для В-клеток, что есть патоген)	CD4, CD8 - неспецифически распознают антиген (узнают МНС, а не пептид; умеют различать МНСI и MHCII)
Основные рецепторы сигналов костимуляции	CD40 (связывается с лигандом CD40L, который экспрессируется Т-клеткой)	CD28 (взаимодействует с комплексом В7 на поверхности антиген-презентирующей клетки)

FcR - рецепторы константных частей иммуноглобулинов

Про локализацию ITIM можно сказать, что есть у НК-клеток

 

SH2 - домен (Src-homologous) - структура, которая обеспечивает очень аффинное связывание с фосфорилированными тирозином, серином или треонином в составе ITАM и ITIM. Без фосфата нет взаимодействия!

4) Иммунологический синапс. устройство и биологическая роль

Иммунологический синапс - взаимодействие Т-клетки с антиген-презентирующей клеткой (АПК). При этом Т-лимфоцит плотно присасывается к клетке-мишени, в полость впрыскиваются цитокины - чтобы действовать локально. В синапсе также участвуют молекулы адгезии и костимуляции, рецепторы и корецепторы.

 

5) Роль киназы lck и фосфатазы CD45 в передаче сигнала от антигенных рецепторов лимфоцитов.

При инициации сигнала с TCR фосфатаза CD45 удаляет ингибирующий фосфат с киназы Lck. До этого в неактивном состоянии киназу Lck поддерживает киназа Csk. В неактивном состоянии киназа Lck свернута калачиком: ее SH2-домен связывается с ее же С-концевым фосфорилированным тирозином). После удаления ингибирующего фосфата киназа Lck изменяет конформацию, автоактивируется, фосфорилирует ITAM. ITAM с двумя фосфорилированными тирозинами - субстрат для Src-киназ с двумя SH2-доменами (например, киназа ZAP-70).

6) Основные физиологические последствия активации TCR.

Основные физиологические последствия активации TCR - фосфорилируются различные сигнальные молекулы (LAT и SLP-76), что приводит к:

 

● активации транскрипционных факторов (через PLCγ)

● повышению клеточной метаболической активности (через Act)

● полимеризации актина и реорганизации цитоскелета (через Vav)

● усилению адгезивных свойств поверхности: усилению “липкости” и кластеризации интегринов (через ADAP)

7) Внутриклеточный кальций и фосфолипиды в активации лимфоцитов. Семейства факторов транскрипции NFAT, NFkB и AP1.

 

Активация факторов транскрипции идет через PLCγ - фосфолипазу гамма. Она расщепляет PIP2 (фосфатидилинозитолдифосфат) на IP3 (инозитолтрифосфат) и DAG (диацилглицерол).

 

IP3 открывает кальциевые каналы в ЭПР и внешней мембране. DAG остается на мембране и привлекает PKC-θ и RasGRP (RAS guanyl-releasing protein), которые запускают МАР-киназный каскад, в котором активируются транскрипционные факторы 3 семейств (это самые важные):

 

● NFAT (через кальций и кальциневрин); одна из молекул этого семейства - мишень циклоспорина А - вещества, которое способно селективно подавлять Т-клеточный ответ (важно при пересадке органов)

● NFkB (через PKC-θ и CARMA)

● AP1 (через RasGRP, RAS и каскады МАР-киназ)

 

8) Роль фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) в костимуляции. Механизм действия CTLA-4.

Молекула костимуляции (В7) появляется в ответ на реакцию врожденного иммунитета. Она узнается молекулой CD28. Через участки с тирозином происходит привлечение и активация фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K). Результатом ее работы является PIP3. PLCγ активируется, только когда привлекается к мембране и садится там на PIP3, заякоренный в мембране.

 

CTLA-4 - антагонист CD28. Он конкурирует с CD28 за связывание с В7 и всегда побеждает, так как более эффективно связывается за счет того, что делает это кластерами. То есть в присутствии CTLA-4 CD28 не связывается с В7. У CTLA-4 внутри ITIM - ингибирующие сигналы.

 

9) Роль ИЛ-2 и альфа-цепи рецептора ИЛ-2 в активации цитотоксических Т-клеток.

Для активации Т-киллера обязательно одновременное физическое взаимодействие с той же дендритной клеткой, с которой взаимодействует Т-хэлпер. При взаимодействии Т-хэлпера с ДК в ДК выделяется молекула костимуляции для Т-киллера (ее запоминать не надо, но вы не сможете забыть - она называется “четыре ай бибил” 4-IBBL).

Очень важна сильная положительная обратная связь через ИЛ-2 и CD25 (альфа-цепь высокоаффинного рецептора ИЛ-2 на поверхности Т-киллера). Сначала ИЛ-2 выделяет Т-хэлпер, а потом ИЛ-2 вызывает выработку ИЛ-2 в самом Т-киллере. Так клон Т-киллеров сам подгоняет себя в росте при пролиферации.

 

ИЛ-2 - пример интеграции сигнальных путей в промоторе его гена. У него в промоторе есть сайты связывания всех транскрипционных факторов из вопроса 3, то есть чтобы его транскрипция шла хорошо, необходим и сигнал от TCR, и сигнал костимуляции - от CD28.

 

10) Лиганды активирующих и ингибирующих рецепторов NK клеток.

Ингибирующие рецепторы связываются с набором молекул MHCI. Это важно, когда NK-клетка учится распознавать свое - ее будет активировать отсутствие этих лигандов = “отсутствие своего”.

 

Активирующие рецепторы связываются со стресс-индуцированными лигандами. NK-клетка активируется в ответ на повышение экспрессии стрессорных белков ("стресс-индуцированное свое").

 

 

11) Логика развития лимфоцитов в первичных лимфоидных органах. Положительная и отрицательная селекция.

Пролиферация - экспрессия первой цепи Pre-B или Pre-T - снова пролиферация - экспрессия второй цепи (теперь есть полные антигенные рецепторы) - селекция (будущий лимфоцит элиминируется, если очень сильно связывается с антигеном либо не связывается вовсе).

Селекция в костном мозге: созревание В-клеток, экспрессирующих два иммуноглобулина - IgM и IgD + отбор клеток, реагирующих только на чужеродные антигены .

B-клетки, иммуноглобулиновые рецепторы которых способны взаимодействовать с собственными антигенами, либо погибают в результате апоптоза , либо приходят в состояние ареактивности (анергии).

Селекция в тимусе: Т-клетки экспрессируют или CD4 (будут хелперами), или CD8 (будут киллерами). Собственно селекция - по TCR-сигналу: если его нет или он сильный - клетка погибает. Если слабый - будет наивная Т-клетка, если умеренный - Т-регуляторная клетка.

 

12) Способы удаления из популяции зрелых лимфоцитов потенциально аутореактивных клонов. Редактирование антигенных рецепторов лимфоцитов.

Это было на примере В-лимфоцитов.

 

Если В-лимфоцит связался с растворенным аутоантигеном, то образуется анергичная В-клетка с с высоким уровнем экспрессии IgD (индукция анергии без костимуляции - механизм иммунологической толерантности).

 

Если В-лимфоцит связался со связанным с поверхностью аутоантигеном (на эритроцитах, МНС, то возможно редактирование рецептора в целях изменения специфичности (путем продолжения экспрессии RAG, перестройки генов легких цепей).

 

Если редактирование не получилось, апоптоз.

13) Первичный и вторичный иммунный ответ. Переключение с IgM на IgG, клетки памяти.

Первичный иммунный ответ - рецепторы лимфоцитов представлены IgM, низкая специфичность связывания с элементами патогенной архитектуры, IgM собран в пентамеры (первая встреча с патогеном, ответ развивается долго). Далее - выработка высокоспецифичного IgG (“подбором” - см. vdj-рекомбинацию), лимфоциты выбрасывают ген константной части IgM

Вторичный иммунный ответ - повторная встреча с патогеном, уже есть лимфоциты с нужным антигеном, ответ развивается очень быстро

Клетки памяти - лимфоциты, формирующие вторичный иммунный ответ

14) Особенности физиологии антигенных рецепторов B-1 и гамма-дельта-Т клеток, позволяющие отнести их к "врожденным лимфоцитам".

популяция клеток В1 – они развиваются в печени новорожденных. Там они производят IgM (при активации – растворимые ИгМ). У них ограничен репертуар специфичности, используют только некоторые V-гены. Изначально настроены на часто встречающиеся гликаны на поверхности бактерий, на некоторые собственные антигены (регуляция, супрессорные цитокины), на собственные стрессорные антигены (экспрессируются в случае повреждений). В1-клетки не формируют иммунологической памяти. Каждый раз, как первый раз. ИгМ всегда в одном и том же количестве.

В1 клетки добавляют мало нуклеотидов на стыки сегментов, репертуар их V-генов ограниченный. Находятся в перитонеальной и плевральной полостях. В отличие от В2 клеток, которые живут и гибнут и обновляются в КМ, В1 клетки, заселившись на свои места локации, самообновляются на месте. Умеют производить самопроизвольно на высоком уровне IgM, часто имеют специфичность к углеводородам. Не формируют памяти.

 

Гамма-дельта T‐клетки могут взаимодействовать с MHCIb, но не с классическими молекулами MHC, и не требуют процессинга антигена для распознввания.

Для большинства гамма-дельта T- клеток лиганды точно не известны.

Гамма-дельта клеток довольно много там же, где В1 клетки. Они необходимы для распознавания небольших фосфолипидов. Есть в перитонеальной полости, их много в эпидермисе кожи, и некоторые из них (которые в частности специфичны к белкам бутирофилинового семейства) выполняют роль распознавания стресса. Бутирофилины на периферии экспрессируются в результате стресса. Пока лиганда нет, экспрессируются иммуносупрессорные цитокины. А при появлении достаточного количества лиганда, включается запуск иммунного ответа. Не формируют иммунологической памяти, относятся к клеткам врожденного иммунитета.

 

15) Позитивная селекция CD4+ и CD8+ Т-клеток в тимусе. MHC-рестрикция.

В кортикальной зоне тимуса происходит позитивная селекция Т-клеток - удаление клеток, у которых очень слабый сигнал от TCR.

Положительной селекции подвергаются дважды положительные тимоциты (CD4+CD8+) Дважды положительные клетки очень чувствительны к апоптозу (в связи с низкой экспрессией ими антиапоптотических факторов, таких, как Вс1-2 и Bcl-XL). Для выживания клеткам нужна поддержка микроокружения. Сигнал, необходимый для выживания, тимоциты получают в ходе положительной селекции. Положительная селекция обеспечивает отбор только тех тимоцитов, которые экспрессируют TCR, обладающие сродством к молекулам МНС. Если TCR обладает сродством к молекуле МНС, тимоцит получает поддерживающий сигнал, основными результатами которого служат повышение экспрессии антиапоптотического фактора Вс1-2 и продвижение тимоцита по клеточному циклу. Внешний признак успешного прохождения тимоцитом положительной селекции — экспрессия маркера активации клетки CD69, а также молекул CD5, CD27 и костимулирующей молекулы CD28, сопровождающаяся повышением плотности экспрессии рецепторного комплекса TCR—CD3на поверхности клетки. Т-лимфоциты, рецепторы которых лишены сродства к МНС, подвергаются апоптозу «по умолчанию».

MHC-рестрикция – распознавание Т-лимфоцитами фрагментов антигенов только в контексте МНС (исключение - суперантигены).

МНС индивидуальны. Т-лимфоциты проходят позитивную селекцию на молекулах MHC, которые у каждого индивидуума свои, и пептидах, которые способны с этими аллелями связаться. У другого индивидуума набор молекул MHC будет другой, пептиды получатся тоже другие, в результате репертуар специфичностей зрелых лимфоцитов также будет отличаться.

Развитие тимоцитов зависит от MHC. если мы подсадим мышке рецепторы на МНС1, то на выходе мы увидим только цитотоксические Т-клетки. У развивающихся тимоцитов в принципе не будет шанса экспрессировать рецептор на MHC2. То же будет, если подсадим мышу рецептор на MHC2.

 

 

 

16) Негативная селекция тимоцитов. Aire и Fas/FasL.

Каким образом развивающимся тимоцитам удается показать все собственные антигены, опасные с точки зрения аутореактивности (это и есть негативная селекция)?

Было непонятно, пока не открыли ген AIRE – это фактор транскрипции, под контролем которого находится около 100 специфичных белков, которые он запускает время от времени в некоторых клетках тимусного эпителия. Индуцирует экспрессию органо- или тканеспецифических генов в тимусе:

- insulin (пожелудочная железа)

- interphotoreceptor retinoid-binding protein (IRBP) (глаз)

- odorant binding protein 1a (слезные железы)

- vomeromodulin (легкие)

 

Если запустить небольшую часть на некоторое время – ничего страшного не произойдет, но в итоге все покажем, что надо. Чтобы поставить ген под контроль AIRE, или убрать, надо просто поменять пару нуклеотидов в промоторном участке гена (легкая регуляция).

Это один из механизмов центральной толерантности. Очень легко настраиваемый - нужно всего лишь поменять несколько нуклеотидов в промоторе для регуляции.

 

Нарушения функции AIRE вызывают аутоиммунный полигландулярный синдром 1-го типа, или хронический кожно-слизистый кандидиоз (autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis- ectodermal dystrophy, APECED) - редкое наследственное заболевание, характеризующееся аутоиммунным ответом на ткани разных органов, преимущественно эдокринных желез.

AIRE-зависимая экспрессия тканеспецифических антигенов в клетках тимусного эпителия - один из механизмов центральной толерантности.

Если тимоцит аутореактивный, то он точно рано или поздно во время созревания встретиться со своим пептидом, и будет уничтожен отбором.

 

FasL и Fas обеспечивают апоптоз (если не удалось перестроить рецептор лимфоцита). Это цитокин и его рецептор, обеспечивающие структурный (инструктивный?) апоптоз. Мыши-нокауты по этим генам - гипертолерантность лимфоцитов, аутоиммунное действие.

 

17) Роль цитокинов в дифференцировке Т-хелперов на периферии.

 

 

18) Негативные последствия несбалансированной дифференцировки Т-хелперов.