Врожденные и адаптивные иммунные реакции во времени и пространстве

1. В каких анатомических структурах происходит фильтрация тканевой жидкости и контроль ее содержимого на чужеродность? Где происходит фильтрация крови?

Лимфатический узел фильтрует тканевую жидкость и контролирует ее содержимое.

Задача - обнаружить и обезвредить чужие биомолекулы и тем более существа (вирусы, бактерии, простейшие и др.)

Селезенка – лимфоидный орган, который контролирует кровь.

 

2. В каких клеточных компартментах находятся патогены и их продукты, для нейтрализации которых нужны Т-киллеры, Th1 клетки и Th2 клетки?

3. Защитные функции антител.

● §Нейтрализация токсина

● §Удаление токсина в виде иммунных комплексов

● §Нейтрализация вируса

● §Препятствие адгезии бактерий

● §Активация комплемента на поверхности вирусов, бактерий и других существ

● §Опсонизация бактерий, вирусов и других патогенов (за счет антител и комплемента)

● §Нацеливание киллеров (через FcR)

● §Защита границ за пределами организма (IgA)

 

4. Механизм иммунной атаки паразитических червей.

Антитела и комплемент повреждают даже многоклеточных паразитов

Антитела в роли «черной» метки, по которой клетки-киллеры атакуют паразитов

Паразитические черви, «меченые» антителами IgG и IgE, подвергаются атаке эозинофильными гранулоцитами. Эозинофилы изливают на поверхность паразита содержимое своих гранул.

 

 

5. Содержимое гранул эозинофилов и свойства его компонентов.

Содержимое гранул эозинофила токсично для многоклеточных паразитов

и некоторых бактерий:

● Eosinophil granule major basic protein

Образует кристаллическое ядро эозинофильной гранулы, участвует в защите от паразитов как цитотоксин. 117 аа мощный фермент против гельминтов, токсичен в отношении некоторых бактерий.

Может оказывать токсические эффекты на организм хозяина:

высвобождение гистамина из тучных клеток и базофилов,

активация нейтрофилов и макрофагов, повреждение эпителиальных клеток, бронхоспазм

● Eosinophil peroxidase

окисилитель, образует гипохлорит анион и другие активные субстанции с бактерицидной активностью

● RNAse, DNAse, Collagenase

● Defensins

● Histamine

 

6. Какой тип антител секретируется через эпителий? По какому механизму?

Через эпителии секретируются антитела изотипа IgA

Poly-Ig receptor переносит IgA или IgM внутри эпителиальной клетки на ее внешнюю (апикальную) мембрану. Здесь ферменты отрезают большой

кусок poly-Ig-рецептора, освобождая секреторный IgA, который состоит из IgA и куска рецептора.

 

 

7. Какой тип Т-клеток помогает В-клеткам в ответе на тимус-зависимые антитены? В чем заключается эта помощь?

Th2 хелпер помогает В клеткам:

•Размножаться

•Дифференцироваться в плазматические клетки

•Переключать изотипы Ig (IgM IgG, IgA, IgE)

•Повышать аффинность антител путем соматических мутаций

 

Т клетки с помощью своего рецептора TCR распознают комплексы [MHC+пептид] на поверхности только тех В клеток, которые схватили и переработали антиген. Только этим В клеткам, реагирующим на антиген, Т клетка и окажет помощь

8. Какой тип Т-клеток и с участием каких молекул помогает макрофагам? В чем заключается эта помощь?

Th1-клетка – это Т-хелпер, помогающий макрофагам очиститься от инфекции

При невозможности избавиться от внутриклеточной инфекции Th1 клетки и макрофаги заключают инфекцию в живую клеточную капсулу, которая называется гранулемой (см. след вопрос)

 

9. Что такое гранулема и как она формируется?

Контактируя с инфицированным макрофагом, Th1-клетка активирует макрофаг. Макрофаг, в свою очередь, активирует Th1-клетку.

Оба типа клеток выделяют химические сигналы (Активированные Тh1 клетки секретируют интерферон-гамма и хемокины (MCF, RANTES), которые привлекают макрофагов и Т клетки. Активированные макрофаги выделяют цитокины,

вызывающие воспаление (TNFα, IL-1β))

Кроме того, Th1-клетки размножаются.

В результате всех процессов вокруг инфицированных макрофагов скапливается много Т клеток и новых макрофагов. Формируется гранулема – живая постоянно обновляющаяся «капсула», в которую заключена инфекция.

 

В основе формирования гранулемы – следующие процессы:

● IFN-γ активирует макрофаги

● IL-2 активирует размножение Т клеток

● TNF-α и TNF-β активируют эндотелйй

● Хемокины (CCL2, Rantes, MCF) привлекают макрофагов и Т клетки в очаг воспаления

 

 

10. Последовательность событий при уничтожении клетки-мишени Т-киллером.

 

Белки литических гранул Т-киллера	Действие на клетку-мишень
Перфорин	Полимеризуется, образуя пору в мембране клетки-мишени
Гранзим	Сериновая протеаза, активирует апоптоз, оказавшись в цитозоле клетки-мишени
Гранулизин	Индуцирует апоптоз

 

10. Реакции гиперчувствительности. Иммунные реакции при трансплантации. Иммунологические методы

2.1. Классификация реакций гиперчувствительности немедленного типа.

2.2. Классификация реакций гиперчувствительности замедленного типа.

2.3. Механизм возникновения сенной лихорадки.

Сенная лихорадка = поллиноз = аллергический ринит

При взаимодействии аллергена (к которому организм не готов) с эпитальными клетками, они выделяют алармины (IL-33, GM-CSF, TSLP), и под их действием возникают врожденные лимфоидные клетки (про которые обещали не забивать головы), и, что важнее, происходит дифференцировка дендритных клеток в направлении, которое способствует Тн2 дифференцировке. Ключевой цитокин при взаимодействии с Т-клетками и дифференциации их в Тн2 - IL-4. Тн2 активируют В-клетки, которые производят IgE.

При повторной встрече с антигеном IgE связывается с ним и узнается Fc-рецепторами тучных клеток, а дальше уже начинается воспалительная реакция.

Википедия: Тучные клетки экспрессируют высокоаффинный рецептор (FcεRI) для Fc-фрагмента IgЕ. Этот рецептор имеет столь большое сродство с IgЕ, что их связывание по сути необратимо. В результате тучные клетки оказываются облепленными IgЕ, которые производятся плазматическими клетками (антителообразующие клетки иммунной системы). Молекулы IgE, как и все антитела, специализируются на одном конкретном антигене.

При аллергических реакциях мастоциты остаются неактивными до связывания аллергена с IgE, которые уже облепили клетку. Как правило, аллергенами являются белки или полисахариды. Антигены связываются с антигенсвязывающими участками, расположенными на вариабельных участках молекул IgE, связанных с поверхностью тучной клетки. Оказывается, что связь двух и более молекул IgE (путем кросс-сопряжения, то есть образования поперечных межмолекулярных связей) обязательна для активации тучной клетки. Кластеризация внутриклеточных доменов Fc рецепторов, соединенных с кросс-связанными молекулами IgE, вызывает сложную последовательность реакций внутри тучных клеток, которая приводит к их активации (и последующей дегрануляции).

 

2.4. Способы подавления аллергических реакций (обратите внимание на уточняющее примечание на слайде 6 в презенетации к 10-й лекции)

* рекомендация к иммунизации низкими дозами аллергена в последнее время дается только детям, т.к. показано, что на взрослых она работает хуже, может привести к появлению аллергии к новым аллергенам, а также к предрасположенности к аллергии у детей, чьи матери получали иммунотерапию аллергенами

2.5. Правила отторжения трансплантатов между аллогенными инбредными линиями мышей.

А) Пересадка кусочка кожи внутри инбредной линии мышей. МНС одинаковые, отторжения не происходит.

Б) Если взять донора из другой линии, будет отторжение, потому что у донора другие аллели МНС, которые не узнаются Т-клетками.

С) Сделать реципиентом мышь, которая получена в результате скрещивание первых двух линий. У нее будут аллели МНС обеих линий, поэтому если донора взять из любой из исходных инбредных линий, отторжения не будет.

D) Если сделать гибрида донором, то его ткани будут отторгаться у любого реципиента, взятого из исходной инбредной линии, потому что в ткани по-любому будут присутствовать аллели МНС из другой линии.

2.6. Прямое и непрямое аллогенное распознавание.

Прямое – АПК клетки реципиента процессируют MHC, появляющийся у умирающих клеток, из клеток донора, просто его фрагменты представляются на своем MHC, и свои клетки распознают пептиды отличия.

Непрямое: пептиды МНС донора - на своем собственном MHC. ?Среди Т-клеток донора во времена положительной селекции тимоцитов было около 1 процента клеток с высокой реактивностью. Донорного MHC не было, поэтому они посчитались нормальными клетками, вышли из тимуса. Доминантная и очень быстрая реакция, преобладающая. Из Джейнвея: донорские АПК клетки мигрируют в лимфоцит, представляют на своем МНС свои антигены Т-клеткам, и те идут убивать трансплантант.

 

2.7. Зачем нужны гибридомы и что требуется для их получения?

Гибридомная технология Слияние плазматических клеток, производящих специфические антитела, с бессмертными раковыми клетками, позволяет получить культуру клеток, производящих моноклональные антитела к нужному антигену

 

Цель: Позволяет получить моноклональные антитела.

После иммунизации у мыши берём плазматические клетки, производящие АТ, и сливаем их с раковыми клетками, которые как плазматические, только АТ не производят. Такой гибрид производит АТ нужной нам специфичности. Чтобы найти правильную плазматическую клетку, обычно производят скрининг, ибо клеток дофига, но не все делают, что надо.

 

2.8. Что такое неонатальный Fc рецептор и какие функции он выполняет?

Неонатальный Fc рецептор - мембранносвязанная молекула, похожая по устройству на МНСI и даже содержащая в своем составе β2-микроглобулин. Она локализуется на эндотелии сосудов в основном. Две самые важные вещи, которые она делает:

1. Отвечает за поступление в кровь IgG, полученного от матери. Этот FcR связывается с IgG при кислом рН (в кишечнике, например) и обеспечивает транспорт иммуноглобулинов через кишечный эпителий.

2. Увеличивает время жизни IgG в циркуляции. Все белки в крови поглощаются эндотелиальными клетками путем пиноцитоза и за счет этого выводятся. Эндосомы сливаются с кислыми лизосомами, в кислой среде неонатальный FcR связывается с IgG, защищает его и потом осуществляет его секрецию.

2.9. В чем отличие ELISPOT от ELISA?

ELISA - иммуно-ферментный анализ.

Есть два антитела к целевому белку, концентрацию которого хотим померить. Эпитопы этих антител не перекрываются, т.е. могут связываться одновременно. Одно антитело - захватывающее - сажаем на пластик. Накапываем образец с нужным белком (+ контроль, в котором концентрация известна), а потом добавляем второе - детектирующее - антитело, в которым связано что-то легко детектируемое. Отмывают, чтобы убрать свободно плавающие антитела, и детектируют, что получилось. Чем больше связанных детектирующих антител, тем сильнее сигнал. Анализ с помощью фотометра.

ELISPOT - модификация ELISA, чтобы измерить продукцию клетками цитокинов.

Принцип такой же, но есть дополнительный шаг. На покрытую захватывающими антителами плашку сажаются клетки (по классике - смесь, в которой ожидается присутствие Тн1-клеток, которые активированы и производят интерферон γ). Они инкубируются (сутки или несколько). Выработанные цитокины связываются прямо рядом с клеткой, которая их синтезировала. Потом клетки отмываются, добавляют детектирующее антитело, и на выходе видно место, где находилась клетка

2.10. Применение антител в проточной цитофлуориметрии.

Цель: Какие есть поверхностные маркеры, а также внутренние, если грамотно продырявить клетку.

Клетки обрабатываются моноклональными АТ, конъюгированными с флуофорами. затем клетки поштучно освещаются лазером и детектируется флуоресценция АТ, делаются выводы, что есть в клетке, а чего нет и в какого количестве.

FACS - клеточный сортер, на основе вышеописанных данных сортирует клетки посредством заряжания капли воды с клеткой. Имея особый заряд и проходя мимо двух электродов, клетка отклоняется от одного и притягивается к другому электроду и падает в разные пробирки.

 

2.11. Применение белков A и G с иммунопреципитации. Иммунопреципитация хроматина.

Белок A

Цель: Чтобы выдергивать АТ из любой смеси.

Что за белок? Стафилококки бывают более и менее патогенные. С менее патогенными наша иммунка нормально справляется и формирует иммунный ответ, а с более патогенным проблема. Они производят белок А (иногда G), который связывает константную часть АТ лучше, чем рецептор фагоцита. И полноценной опсонизации бактерии не происходит.

Иммунопреципитация хроматина.

Цель: Можно количественно узнать, на каких участках генома сидят разные факторы транскрипции, гистоны и прочее.

Поливаем клетки формальдегидом, чтобы сшить все белки и НК находящиеся рядом. Затем подробить ДНК, и отсеквенировать, чтобы понять где сидят ТФ, полимераза и т.д. Ключевой момент – шарики с антителами, позволяют обогатить выборку интересующими белками.