Методические указания.

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФГБОУ ВО Ульяновский ГАУ

Пульчеровская Л.П., Васильев Д.А., Золотухин С.Н.

ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ

ПО ВЕТЕРИНАРНОЙ ИММУНОЛОГИИ
учебное пособие для студентов
факультета ветеринарной медицины и биотехнологии, обучающихся по специальности 36.05.01 «Ветеринария»

Ульяновск – 2018

УДК 619:616.9

Пульчеровская, Л.П. Ветеринарная иммунология: учебное пособие для студентов факультета ветеринарной медицины и биотехнологии, обучающихся по специальности 36.05.01 «Ветеринария» / Л.П.Пульчеровская, Д.А.Васильев, С.Н.Золотухин – Ульяновск: Ульяновский ГАУ, 2018. - 59 с.

 

 

Рецензент: Феоктистова Н.А., кандидат биологических наук, доцент кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГБОУ ВО Ул ГАУ

 

Учебное пособие по дисциплине «Ветеринарная иммунология» составлено на основании рабочей программы, целью которой является дать студенту информацию и подробно разъяснить ключевые положения разделов названной дисциплины. Пособие включает темы практических работ, контрольные вопросы по дисциплине. Предназначено для студентов, обучающихся по специальности 36.05.01 – Ветеринария.

Печатается по решению методической комиссии факультета ветеринарной медицины и биотехнологии Ульяновская ГСХА Протокол методической комиссии факультета ветеринарной медицины и биотехнологии №8 от «30» марта 2018 г.

 

© Пульчеровская Л.П., Васильев Д.А., Золотухин С.Н., 2018.

© ФГБОУ ВО Ульяновский ГАУ, 2018

Занятие 1

Тема «ОСНОВЫ ИММУНОДИАГНОСТИКИ»

Цель занятия:

1. Ознакомить студентов с основными понятиями и задачами иммунодиагностики.

2. Изучить сбор иммунологического анамнеза и характеристику основных иммунопатологических синдромов.

3. Ознакомить студентов с основными тестами лабораторной иммунодиагностики.

 

Материалы и оборудование:мультимедийная презентация, учебные видефильмы.

Методические указания.

Иммунология - наука об иммунитете. Она изучает проявление, механизмы и способы управления иммунитетом, а также разрабатывает иммунологические методы диагностики, лечения и профилактики болезней человека и животных.

Основу иммунодиагностики составляют исследования лимфатических уз­лов и крови.

Иммунохимия, изучает на молекулярном уровне механизмы иммунитета (способность организма защищать собственную целостность, в т.ч. невосприимчивость к инфекционным заболеваниям и биологическую индивидуальность), а также компоненты, участвующие в иммунном ответе. К последним относятся:

• антигены - биополимеры (гл. обр. белки и полисахариды. а также их синтетические аналоги), вызывающие развитие иммунного ответа, в т.ч. аллергию;

• антитела - белки, вырабатывающиеся в организме в ответ на воздействие антигена;

• комплементсистема из ряда сывороточных белков, участвующая в иммунном ответе;

• рецепторы лимфоидных и др. клеток иммунной системы (напр., моноядерных фагоцитов), а также продуцируемые этими клетками вещества, регулирующие иммунный ответ.

При исследовании лимфатических узлов у людей и животных используют методы осмотра и пальпации, при необходимости прибегают к пункции или биопсии с дальнейшим цитологическим либо гистологическим исследованием пунктата или срезов. У здоровых макроорганизмов можно исследовать лишь незначительное количество поверхностных лимфатических узлов, так как их размеры невелики, подавляющее большинство расположено глубоко в подкожной клетчатке и недоступно пальпации.

Изменения лимфатических узлов. Наиболее часто отмечают острую или хроническую припухлость и гиперплазию. Сильная припухлость лимфатических узлов - следствие их острого паренхиматозного воспаления с серозно-клеточной инфильтрацией (лимфаденит). При этом лимфатические узлы увеличиваются в размере, опухают, становятся плотными, болезненными, малоподвижными; их дольчатость мало ощутима при пальпации; температура кожи над узлами несколько повышена; поверхность узлов становится гладкой и ровной. Воспаление лимфатических узлов наблюдается при многих острых инфекционных заболеваниях, а также флегмоне, рините, гайморите, фарингите, мастите, эндометрите и др.

У лошадей чаще всего отмечают изменения в подчелюстных лимфатических узлах при гриппе, мыте, инфекционном катаре верхних дыхательных путей контагиозной плевропневмонии, инфекционной анемии и сапе.

Острое воспаление лимфатических узлов может протекать и с нагноением. При этом в лимфатических узлах образуются абсцессы. При фарингите, туберкулезе или сапе отмечаются воспаление подчелюстных лимфатических узлов, затем острый воспалительный процесс переходит в гнойный. В лимфатических узлах образуется гной, узлы флюктуируют при пальпации. Воспалительный процесс может распространиться на околоушные железы. При этом часто возникают расстройства глотания и дыхания. Хроническое воспаление лимфатических узлов происходит вследствие разрастания соединительной ткани как в самом узле, так и в окружающих тканях. Лимфоузлы становятся плотными, бугристыми и безболезненными. Хроническое воспаление часто наблюдается при сапе и туберкулезе.

Гиперплазия лимфатических узлов отмечается у крупного рогатого скота при лимфолейкозе, лимфогрануломатозе и характеризуется значительным увеличением лимфатических узлов. Нагноения чаще всего не происходит, при пальпации узлы увеличены, безболезненны.

Основные задачи иммунодиагностики. Иммунодиагностика предусматривает:

• диагностику врожденной недостаточности иммунной системы, компле­мента и фагоцитоза (первичные иммунодефициты);

• своевременное выявление приобретенных иммунологических дефектов (вторичные иммунодефициты);

• диагностику иммунологических проявлений соматической патологии;

• специфическую диагностику аллергии;

• диагностику аутоиммунной патологии;

• диагностику лимфопролиферативных заболеваний;

• подбор доноров и реципиентов при пересадке органов, тканей, эмбрионов;

• диагностику дефектов иммунной системы при опухолях и их лечении;

• выявление конкретного иммунологического дефекта и подбор (в том числе в тестах in vitro) способа иммунокоррекции;

• анализ эффективности иммуноррекции;

• диагностику и лечение иммунопатологии репродуктивной функции (в том числе «иммунных» форм бесплодия);

• диагностику и профилактику иммунологических конфликтов, возникающих при трансплантации эмбрионов (эмбрион, полученный от донора, является для реципиента чужеродной тканью и действует так же, как антиген, но вызывает более сильный иммунный ответ, чем оплодотворенная яйцеклетка собственного организма).

Для постановки диагноза иммунопатологического состояния используют следующие приемы:

I. сбор иммунологического анамнеза;

II. постановку диагностических тестов непосредственно у исследуемых макроорганизмов (тесты in vivo);

III. постановку иммунологическх тестов in vitro.

 

I. СБОР ИММУНОЛОГИЧЕСКСКОГО АНАМНЕЗА И ХАРАКТЕРИСТИКА ОСНОВНЫХ ИММУНОПАТОЛОГИЧЕСКИХ СИНДРОМОВ

 

При сборе иммунологического анамнеза, проводящегося в соответствии с предполагаемыми иммунологическими отклонениями в организме животного, необходимо обращать особо внимание на проявление наиболее вероятных иммунопатологических синдромов. Среди них наиболее часто встречается шесть:

1. инфекционный синдром;

2. аллергический синдром;

3. аутоиммунный синдром;

4. врожденный (первичный) иммунодефицит;

5. приобретенный (вторичный) иммунодефицит;

6. лимфопролиферативный синдром.

 

1. Инфекционный синдром

- длительная лихорадка невыясненной этиологии;

- хронические инфекции (синуситы, отиты, лимфадениты);

- часто повторяющиеся и хронически протекающие бронхиты и пневмонии;

- бактериальные инфекции кожи и подкожной клетчатки (пиодермии, фурункулезы, флегмоны, абсцессы);

- грибковые инфекции кожи, слизистых оболочек и копыт;

- паразитарные инфекции;

- афтозные стоматиты;

- рецидивирующие гнойные конъюнктивиты;

- повторные лимфодениты;

- хронические урогенитальные инфекции (хронический гнойный вульвит, уретрит, часто повторяющиеся циститы и пиелонефриты);

- дисбактериоз, хронические гастроэнтероколиты с диареей невыясненной этиологии;

- генерализованные инфекции (сепсис).

 

2. Аллергический синдром:

- аллергопатология кожи (дерматит);

- аллергопатология области носоглотки;

- бронхиальная астма, хронический астматический бронхит, гиперчувствительные пневмонии;

- непереносимость пищевых продуктов, лекарственных средств и химических соединений.

 

3.Аутоиммунный синдром:

- воспалительные заболевания опорно-двигательного аппарата (ревматоидный артрит и др.);

- гломерулонефрит;

- патология щитовидной железы, инсулинзависимый сахарный диабет и другие гормональные нарушения;

- неспецифический язвенный колит;

- цитопенические болезни крови;

- аутоиммунные заболевания печени;

- аутоиммунные формы бесплодия, патология беременности.

 

4.Первичные иммунодефициты.

(Чаще выявляются у детей)

- синдром Луи-Бар: (расстройство координации произвольных движений) + телеангиоэктазии (локальное расширение капилляров и мелких концевых артерий) + участки де- и гиперпигментации;

- синдром Вискотта-Олдрича: геморрагии + экзема + тромбоцитопения; болеют только мальчики;

- синдром Ди Джорджи: судороги + пороки развития лицевого скелета и сердечно-сосудистой системы + гипоплазия тимуса; и др.

 

5. Вторичные иммунодефициты.

Вторичные, или приобретенные, иммунодефициты заслуживают внимания у клиницистов в связи со сложностью их протекания. В зависимости от причин, их вызывавших, вторичные иммунодефициты подразделяют на следующие группы:

- физиологические;

- патологические;

- вирусные;

- стрессовые;

- экологические;

- нарушения в кормлении животных (голодание), несбалансированные рационы и т. д.;

- иммунотоксическое действие лекарств, экологических факторов, отсутствие моциона, недостаточное ультрафиолетовое облучение, нарушения зоогигиенических параметров содержания животных, их чрезмерная эксплуатация.

 

6. Лимфопролиферативный синдром:

- опухоли в иммунной системе (лимфолейкоз, лимфосаркома);

- гиперплазия всех групп лимфатических узлов с воспалительными процессам в них в сочетании с частыми бакте­риальными инфекциями различной локализации;

- мононуклеоз в анамнезе.

 

II. ОСНОВНЫЕ ТЕСТЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ИММУНОДИАГНОСТИКИ

 

В основе клинической иммунологии лежит оценка иммунологических параметров в норме и при патологии. Все существующие в настоящее время лабораторные иммунологические тесты согласно классификации, предложенной Институтом иммунологии РАМН, можно разделить на тесты первого и второго уровня (Р. М. Хаитов и др., 1995).

 

Тесты первого уровня (ориентирующие):

• подсчет общего числа лимфоцитов (абсолютное и относительное содержание в периферической крови);

• определение количества Т- и В-лимфоцитов;

• оценка фагоцитарной активности нейтрофилов;

•определение основных классов сывороточных иммуноглобулинов (IgA, IgM, IgG), комплемента.

 

Тесты второго уровня в отличие от тестов первого уровня ставят избирательно, в зависимости от того, какие цели преследует проводимое иммунологическое исследование.

 

Тесты второго уровня (аналитические):

• определение Т- и В-лимфоцитов и их субпопуляций;

• определение циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК);

• постановка реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ);

• определение комплемента, лизоцимной и бактерицидной активности сыворотки крови;

• определение специфического IgE;

• определение NK-киллеров, естественных антител, а также любые дру­гие исследования состояния иммунной системы.

 

При оценке показателей иммунитета необходимо исключить возможность их колебаний в связи с эксплуатацией животных, продуктивностью, временем суток, режимом содержания и кормления.

 

III. ПОСТАНОВКА ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ТЕСТОВ IN VITRO

 

1. Агглютинационные тесты;

2. Реакция преципитации;

3. Реакция иммунного лизиса;

4. Метод флюоресцирующих антител;

5. Иммуноферментный анализ;

6. Метод иммуноблотинга;

7. Радиоиммунный анализ;

8. Диагностика иммунопатологических состояний.

 

Контрольные вопросы:

1. Иммунология как наука, ее цели и задачи.

2. Приемы, используемые для постановки диагноза иммунопатологического состояния и их краткая характеристика.

3. Сбор иммунологического анамнеза и характеристика основных иммунопатологических синдромов.

4. Основные тесты лабораторной иммунодиагностики и их характеристика.

 

Занятие 2

Тема «МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ОРГАНИЗМА»

 

Цель занятия:

1. Ознакомить студентов с методом определения бактерицидности кожи.

2. Ознакомить студентов с методом определения аутомикрофлоры кожи.

3. Ознакомить студентов с методом определения бактерицидной активности сыворотки крови.

4. Ознакомить студентов с методом определения лизоцимной активности сыворотки крови.

5. Ознакомить студентов с методом определения фагоцитарной активности нейтрофилов.

 

Материалы и оборудование:пробирки со стерильным физраствором по 4,5 мл, оптический стандарт мутности в 500 млн микробных тел, градуированные пипетки на 1 мл, резиновые груши, чашки Петри со средами: Эндо, Коростелева, кровяным агаром, казеиновая среда, МПА; стерильные скальпели, спиртовки, 0,25%-ный раствор нашатырного спирта, предметные стекла, стерилизатор, суточную агаровую культуру E.coli, суточная агаровая культура лизируемого микрококка, фотоэлектроколориметр КФК-2 МП, центрифуга на 1000 об/мин, наборы красок по Май-Грюнвальда и Романовского-Гимзы, кровь с/х животных, цитрат натрия, камеруа Горяева.

Методические указания:

Определение бактерицидности и аутомикрофлоры кожи. Кожа и слизистые оболочки являются для антигенов, в том числе для микроорганизмов, не только механическим барьером, но и имеют ряд механизмов для их уничтожения. Так, если на кожу животных нанести некоторое количество кишечных палочек Е. coli, то уже через 5 мин значительная часть их погибает. На этом основан один из способов определения бактерицидных свойств кожи. Бактерицидность кожи (т. е. ее способность убивать бактерии) во многом зависит от кислотности среды. Предполагается, что этот эффект связан с выделением потовыми и сальными железами молочной и жирных кислот. Выделения сальных желез содержат насыщенные жирные кислоты, обладающие бактерицидным действием.

Бактерицидность кожи обусловлена также экстрацеллюлярными (комплемент, пропердин, α- и β-лизины) и интрацеллюлярными - внутриклеточными (лизоцим, лейкин, ферменты) факторами. Однако следует отметить, что бактерицидность кожи не проявляется в отношении так называемых «резидентных» микроорганизмов - стафилокок­ков, сарцин, негемолитических стрептококков, дифтероидов, дрожжеподобных грибов и ряда других, которые не только приспособились к постоянному обитанию на коже, но и составляют ее нормальную аутомикрофлору, оказывают антагонистическое действие относительно транзиторных микроорганизмов, которые могут находиться на коже лишь временно и легко удаляются с нее. Таким образом, для характеристики барьерных свойств кожи следует изучить ее бактерицидную способность и состав аутомикрофлоры.

Задание 1. Определение бактерицидности кожи

 

1. Готовят взвесь суточной агаровой культуры кишечной палочки концентрацией по оптическому стандарту в 500 млн микробных тел в 1 мл; 0,5 мл этой культуры переносят в пробирку с 4,5 мл стерильного физиологического раствора; получают взвесь концентрацией 50 млн микробных тел в 1 мл; 0,5 мл этой смеси переносят вновь в 4,5 мл стерильного физиологического раствора (5 млн микробных тел в 1 мл) и т. д. до концентрации 500 микробных тел в 1 мл.

2.Равномерно рассеивают 0,1 мл этой микробной взвеси на чашке Петри со средой Эндо.

3.Среду Эндо разрезают стерильным скальпелем по диаметру на четыре равные части, из которых одну сразу же прикладывают засеянной стороной к коже и тут же снимают с нее, а остальные три оставляют в течение 5 мин на участках кожи в области предплечия, живота, бедра.

4.Все пластинки со средой Эндо укладывают засеянной стороной вверх вновь на чашку Петри, которую помещают в термостат температурой 37 °С на 24 ч.

5.На следующие сутки подсчитывают количество колоний кишечной палочки на всех участках питательной среды Эндо и определяют (в процентах) интенсивность ее отмирания в течение 5 мин на отдельных частях кожи.

 

Задание 2. Определение аутомикрофлоры.

 

1. Пластинки с кровяным агаром, со средами Коростелева и Эндо длиной 2 см, шириной 1 см, толщиной 0,5 см вырезают стерильным скальпелем или (лучше) специальным шаблоном из чашки Петри с этими питательными средами, укладывают их на предметное стекло так, чтобы расстояние между пластинками составляло около 1 см.

2. Предметное стекло с пластинками прикладывают к участкам кожи, предплечья, живота и бедра для определения состава поверхностной микрофлоры.

3. Те же участки кожи протирают слабым (0,25%-ным) раствором нашатырного спирта, и после его подсыхания на кожу вновь накладывается предметное стекло с питательными средами для характеристики глубокой аутомикрофлоры кожи.

4. Все предметные стекла укладывают в стерилизатор, на дне которого находится влажная фильтровальная бумага, и помещают на 24 ч в термостат при 37 °С. Через 24 ч по росту на кровяном агаре определяют общую микробную обсемененность кожи и наличие штаммов с гемолитическими свойствами: по росту на среде Коростелева – наличие на коже главным образом стафилококков, в том числе и сбраживающих манит (желтые колонии); по росту на среде Эндо - наличие главным образом кишечных бактерий.

Указанная методика позволяет оценить не только загрязнение кожи микроорганизмами, но и наличие штаммов с признаками патогенности – гемолитические, маннитсбраживающие формы. В норме на пластинках с питательными средами вырастают немногочисленные колонии, даже на кровяном агаре их число редко превышает 10-30, бактерицидность кожи составляет 80%. Увеличение обсемененности кожи микроорганизмами, изменение качественного состава микрофлоры (появление большого количества гемолитических, маннитсбраживающих штаммов, кишечных бактерий) свидетельствует о снижении бактерицидности барьерных свойств кожи.

Задание 3. Определение лизоцимной активности сыворотки крови

Ингредиенты: 0,5%-ный раствор NaCl, суточная агаровая культура лизируемого микрококка, разведенная в этом растворе до концентрации 1 млрд микробных тел в 1 мл.

Аппаратура: фотоэлектрокалориметр КФК-2 МП.

Ход определения: 1.К 0,1 мл исследуемой сыворотки крови прибавляют 0,4 мл 0,5%-ного раствора NaCl и 2 мл одномиллиардной взвеси в том же растворе суточной агаровой культуры микрококка.

2.В качестве контроля используют 0,4 мл 0,5%-ного раствора NaCl с добав­лением 2 мл одномиллиардной взвеси суточной агаровой культуры лизирующего микрококка.

3.Содержимое кювет перемешивают тонкой стеклянной палочкой и определяют их оптическую плотность при зеленом светофильтре в кюветах с рабочей длиной 10 мм. Затем пробы в кюветах помещают в термостат на 3 ч при температуре 37 °С. Через 3 ч снова определяют их оптическую плотность. Лизис микробных клеток происходит и в контроле, однако не превышает 10-15 %.

4.Расчет процента лизиса микробных тел производят по формуле:

 

(Д₀ -Д₁)-100 (Дк₀ -Дк₁)-100
Д₀ Дк₀

 

Где:

Д₀- оптическая плотность содержимого опытных кювет до инкубации;

Д₁-оптическая плотность содержимого опытных кювет после инкубации;

Дк₀ - оптическая плотность содержимого контрольных кювет до инкубации;

Дк₁ - оптическая плотность содержимого контрольных кювет после инкубации.

 

Задание 4. Определение бактерицидной активности сыворотки крови

 

Определение бактерицидной активности сыворотки крови основано на учете изменений оптической плотности среды, содержащей микробную взвесь и сыворотку крови.

Подготовка компонентов к исследованию.

Вначале готовят суточную агаровую культуру E.coli, затем смывают ее физиологическим раствором и полученную суспензию по оптическому стандарту доводят до содержания 500 млн микробных тел в 1 мл. В качестве питательной среды при определении бактерицидной активности сыворотки крови используют казеиновую среду, которую готовят из казеинового гидролизата, обогащенного пептоном по следующей прописи: казеиновый гидролизат с содержанием 200 мг% аминного азота; 0,5 % пептона; 0,5 % Na₂HP0₄; 0,3 % NaCl. Смесь подщелачивают до рН 7,0.

Ход определения. В стерильные кюветы разливают пипеткой по 4,5 мл казеиновой среды и добавляют по 0,5 мл испытуемой сыворотки крови (опытные кюветы). Затем в каждую опытную кювету микропипеткой вносят по 0,005 мл или бактериологической петлей диаметром 4 мм взвесь суточной агаровой культуры кишечной палочки.

В контрольные кюветы вносят те же компоненты, что и в опытные, только вместо сыворотки крови в них добавляют по 0,5 мл стерильного физиологического раствора. Содержимое всех кювет тщательно перемешивают платиновой иглой, после чего их закрывают ватно-марлевыми пробками. Затем на фотоэлектроколориметре КФК-2 МП определяют оптическую плотность среды в опытных и контрольных кюветах сразу. После этого кюветы ставят в термостат при температуре 37 °С. Повторно оптическую плотность содержимого кювет определяют через 3 ч. Установку «0» на ФЭК производят с помощью кюветы, заполненной дистиллированной водой.

Бактерицидную активность сыворотки крови вычисляют следующим образом: вначале определяют, какой процент по отношению к контролю составило нарастание оптической плотности в опытных кюветах. Для этого разность между показателями второго и первого измерений в опыте умножают на 100 и делят на разность между вторым и первым измерением в контроле.

 

(Д_{опр.через 3 ч} -Д_{опр.сразу}) •100
Д_{0контр. через 3ч} –Д_{контр. сразу}

 

Однако удобнее выражать бактерицидную активность сыворотки крови в показателях не нарастания оптической плотности, а ее угнетения.

 

Задание 5. Определение фагоцитарной активности нейтрофилов по методу В. М. Бермана, Е. М. Славской.

 

Принцип метода. Метод основан на учете числа бактерий, захваченных нейтрофилами в процессе их совместного инкубирования в термостате.

Ход определения.В две стерильные центрифужные пробирки наливают по 0,2 мл 2%-ного раствора натрия цитрата и добавляют по 0,2 мл исследуемой крови. Пробирки с содержимым центрифугируют при скорости 1000 об/мин в течение 3-5 мин. После центрифугирования пробирки ставят на 10-15 мин в бытовой холодильник для уплотнения лейкоцитарной пленки.

Пипеткой удаляют плазму и снимают лейкоцитарную пленку с небольшим количеством эритроцитов, общий объем сыворотки крови 0,1 мл. Добавляют равное количество микробной взвеси кишечной палочки в 0,85%-ном растворе натрия хлорида, содержащей по оптическому стандарту мутности 500 млн микробных тел в 1 мл. Пробирки помещают в термостат на 30 мин при 37°С, периодически их встряхивая. Одновременно в термостат ставят для подсушивания чашки Петри с мясо-пептонным агаром, предварительно извлеченные из холодильника и находившиеся 14-20 мин при комнатной температуре.

Пробирки извлекают из термостата и центрифугируют 3-5 мин при 1000 об/мин. Надосадочную удаляют, а к осадку добавляют тройной объем физиологического раствора, после чего пробирки вновь центрифугируют, надосадочную жидкость удаляют пастеровской пипеткой. После встряхивания осадка его наносят в виде двух капель на поверхность подсушенного агара - по одной капле на край каждой половины чашки Петри. Толстым стеклом с гладкими краями (можно использовать камеру Горяева), слегка подогретым, примерно до 37 °С, делают два мазка на поверхности агара, к одному из которых сразу же прикладывают слегка подогретое стекло и быстро снимают его пинцетом с агара. Чашку Петри со вторым мазком крови помещают в термостат при 37 °С на 1 ч, после чего к нему прикладывают второе, слегка подогретое предметное стекло.

2.Стекла с отпечатанными на них мазками фиксируют и сначала окрашивают течение 4 мин краской Май-Грюнвальда, а затем после смывания краски водой докрашивают в течение 55 мин краской Романовского-Гимзы (на 10 мл воды обычно вносят 15 капель краски). Мазки промывают водопроводной водой и высушивают на воздухе. Под микроскопом в обоих мазках определяют: процент фагоцитоза - количество фагоцитирующих нейтрофилов при подсчете 100 клеток; фагоцитарное число - среднее число микроорганизмов, фагоцитированных одним нейтрофилом. Отдельно подсчитывают поглощенные живые (синие) и мертвые бактерии, находящиеся в стадии переваривания (фиолетовые, розовые, нередко разбухшие). Разница между процентом клеток, содержащих переваренные микроорганизмы, во втором и первом мазках составляет индекс переваривания. Подсчитывают микробную емкость крови путем умножения числа нейтрофилов, содержащихся в 1 мм³ крови, на фагоцитарное число, а также переваривающую способность крови, умножением этого же количества нейтрофилов на среднее число переванных одним нейтрофилом бактерий. Процент фагоцитоза, фагоцитарное число, фагоцитарная (микробная) емкость, индекс переваривания и переваривающая способность крови достаточно полно характеризуют фагоцитарную реакцию нейтрофилов крови.

Контрольные вопросы:

1. Определение бактерицидности кожи

2. Определение аутомикрофлоры

3. Определение лизоцимной активности сыворотки крови

4. Определение бактерицидной активности сыворотки крови

5. Определение фагоцитарной активности нейтрофилов

Занятие 3