ГЛАВНЫЙ ОПЫТ РЕАКЦИИ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА

 

При постановке главного опыта РСК студенты работают вместе по два человека. Предварительный учет. РСК осуществляют после пребывания проби­рок второй раз в водяной бане.

Главный опыт РСК - собственно метод диагностического серологического исследования, все описанное выше на предыдущих двух занятиях, является лишь, подготовкой к постановке РСК. Каждую пробу сыворотки разводят 1 : 10, инактивируют и разливают в две пробирки по 0,5 мл, следовательно, в штативы ставят два ряда пробирок с количеством пар, соответствующих числу имеющихся для исследования проб сывороток, плюс еще две пары (с нормальной и позитивной сыворотками) для контроля. Контрольные сыворотки должны быть при любом количестве исследуемых проб (даже если всего одна) и от того, же вида животного. Во все пробирки первых рядов сывороток добавляют по 0,5 мл антигена. Во вторые ряды всех сывороток (без антигена); добавляют по 0,5 мл физраствора, затем во все пробирки (первого и второго рядов) вносят комплемент по 0,5 мл (рис. 10), встряхивают и помещают в водя­ную баню на 20-40.мин (37-38 °С). Это бактериолитическая система. После выдерживания ее в водяной бане во все пробирки добавляют компоненты гемолитической системы - гемолизин и взвесь эритроцитов барана по 0,5 мл каждого, встряхивают, вторично ставят в водяную баню на 15-20 мин.

Учет результата производят дважды: первый - предварительный, сразу после водяной бани, и второй - через 18-20 ч пребывания пробирок при комнатной температуре (окончательный). При первом учете обращают внимание (как указано в предыдущем занятии) на пробирки второго ряда и пробирки с нормальной сывороткой и антигеном (первый ряд), где ожидается гемолиз; в пробирках с позитивной сывороткой и антигеном - отсутствие гемолиза (эритроциты во взвешенном состоянии, жидкость мутная). Окончательный учет (на следующий день) - в пробирках, где уже был отмечен ранее гемолиз, никаких изменений нет. В пробирках, где отсутствовал гемолиз (первый ряд с антигеном), четко выражен результат отсутствия гемолиза - все эритроциты, находившиеся при первом учете во взвешенном состоянии, осядут на дно, жидкость над осадком становится прозрачной, бесцветной.

Показания реакции в пробирках с исследуемыми сыворотками считаются достоверными, если в пробирках с позитивной сывороткой и антигеном нет гемолиза при полном гемолизе в пробирках с позитивной сывороткой без антигена и во всех пробирках с нормальной сывороткой

Результат РСК принято выражать в крестах по степени его интенсивности:

++++(#) - полная задержка гемолиза (полное осаждение эритроцитов), результат (диагноз) положительный;

+++ (три креста) - задержка гемолиза хорошо выражена, имеется значительный осадок эритроцитов, жидкость над осадком слабо-розового цвета, ре­зультат положительный;

++ и ++- (то есть два и два с половиной креста) - частичная задержка гемолиза (имеется компактный осадок эритроцитов, жидкость интенсивно окрашена), сомнительный результат;

+ (один крест) - слабая задержка гемолиза, незначительный осадок, жид­кость интенсивно окрашена в красный цвет, результат отрицательный;

- (минус) - полный гемолиз («лаковая кровь»), отсутствие осадка, результат отрицательный.

Данная реакция сопровождается контролями антигена, комплемента, гемолизина, эритроцитов, как и при титрации гемолизина и комплемента плюс еще пробирка контроля антигена: 0,5 мл антигена . + 0,5 мл эритроцитов + + 1,5 мл физраствора. Все контрольные пробирки встряхивают, помещают в водяную баню на 10-15 мин - гемолиза не должно быть.

РСК используют:

1) для обнаружения в сыворотке больного животного специфических антител (при диагностике бруцеллеза, сапа, лептоспироза, перипневмонии и др.);

2) для выявления в исследуемом материале специфического антигена (бактериального или вирусного) с помощью специфических иммуносывороток.

Модификации методики постановки РСК:

1)реакцию ставят в половинном объеме компонентов (в 2 раза меньше) - каждый компонент берут в количестве 0,25 мл, общий объем жидкости в пробирках будет составлять 1,25 мл;

2) при разливке сывороток для исследования их сразу не разводят 1 : 10 перед инактивацией, а все сыворотки микропипеткой разливают в пробирки в нативном (не разведенном) виде по 0,05 мл, другой пипеткой добавляют по 0,45 мл физраствора (достигается разведение 1 : 10) и инактивируют. Далее постановка идет, как обычно (описано выше);

3) титруют комплемент только в гемолитической системе, устанавливают титр. Главный опыт РСК ставят с двумя дозами комплемента - на два разряда выше (на две дозы) фактического титра, например: если титр комплемента в гемолитической системе 0,25 мл, для главного опыта используют 0,28 и 0,31.

Реакция длительного связывания комплемента (РДСК)предложена Якобшталем (1910) как более, эффективная по чувствитель ности в сравнении с классической методикой РСК. Суть методики заключается в том, что бактериолитическую систему выдерживают при трех различных температурных режимах: после смешения компонентов выдерживают при комнатной температуре 15 мин, затем помещают при низкой температуре (4 °С) в рефрижератор на 18-20 ч, после чего пробирки ставят в водяную баню на 15 мин. Затем добавляют компоненты гемолитической системы, встряхивают, вновь помещают в водяную баню и учитывают результат реакции, как обычно при РСК. Эта модификация РСК рекомендована для диагностики туберкулеза (разработана Луценко), кампилобактериоза, бруцеллеза и др.

Контрольные вопросы.

1. Сущность РСК, каково назначение гемолитической системы.

2. Гемолизин, принцип методики его получения и титрации.

3. Что означает рабочий титр гемолизина, почему нельзя пользоваться гемолизином в фактическом титре?

4. Комплемент, его назначение вРСК. Что произойдет, если комплемент не титровать?

5. Чем объясняется необходимость инактивации сывороток для исследования РСК?

6. Суть методики РДСК.

 

Занятие 7

Тема «РЕАКЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕЧЕНЫХ АНТИТЕЛ ИЛИ АНТИГЕНОВ»

 

Цель занятия:Познакомиться и усвоить сущность методов иммунодиагностики: методом флюоресцирующих антител, иммуноферментным анализом, методом иммунодлотинга, радиоиммунным анализом и диагностикой иммунопатологических состояний.

 

Материалы и оборудование:мультимедийная презентация

 

Методические указания. После объяснения материала преподавателем студенты конспектируют материал.

 

МЕТОД ФЛЮОРЕСЦИРУЮЩИХ АНТИТЕЛ

 

Для обнаружения антигенов и антител используют прямой и непрямой методы иммунофлюоресценции. Основу метода флюоресцирующих антител (МФА) составляет реакция между антигеном и специфическим по отношению к нему антителом. Флюоресцирующие антитела - это иммуноглобулины, выделенные из иммунных сывороток и меченные флюорохромами. Для этих целей используют флюоресцеина изотиоцианат (ФИТЦ). Меченный флюорохромом иммуноглобулин при нанесении на исследуемый мазок специфически адсорбируется на поверхности антигена, прочно с ним связываясь. Если антиген не комплементарен антителу, то при промывании препарата такие антитела легко смываются.

В России используют, как правило, прямой МФА. С целью уменьшения неспецифической флюоресценции исследуемых препаратов применяют контрастирование неспецифического свечения. Исследуемые препараты при этом окрашивают смесью специфических флюоресцирующих антител, меченных ФИТЦ, обеспечивающим зеленое свечение, и альбумина нормальной сыворотки быка (БСА), меченного родамином, дающим красную люминесценцию фона.

Препараты для люминесцентной микроскопии готовят на хоро­шо обезжиренных предметных стеклах. Все надписи делают простым карандашом на матовой площадке у края предметного стекла. Несколько капель исследуемого материала наносят пастеровской пипеткой или бактериологической петлей вдоль предметного стекла.

Мазки и препараты культур клеток в течение 15-20 мин фиксируют в охлажденном химически чистом закрытом сосуде с обезво­женным ацетоном.

Окрашивают мазки при температуре 37 °С в течение 30 мин во влажной камере, чтобы капли флюоресцирующей сыворотки не высыхали. После этого избыток флюоресцирующих смесей смывают водой и препараты исследуют с помощью люминесцентного микроскопа.

Результаты иммунофлюоресцентной микроскопии учитывают по интенсивности специфической флюоресценции исследуемого объекта.

Непрямой метод более доступен, чем прямой. С помощью одной и той же антивидовой сыворотки, меченной флюорохромом, можно обнаружить различные антигены. Например, имея набор специфических иммунных сывороток кроликов к различным вирусным антигенам и единую меченую глобулиновую фракцию сыворотки лошади, иммунизированной нормальной сывороткой кроликов, можно осуществлять лабораторную диагностику многих вирусных инфекций.

 

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ

 

В настоящее время иммуноферментный анализ (ИФА) является наиболее широко распространенным иммунологическим методом. Принцип ИФА аналогичен непрямому варианту МФА, но имеет ряд отличий:

• антитела или антигены фиксируются не на стеклах, а на внутренней поверхности полистироловых планшетов для иммунологических реакций;

• в качестве метки используется не флюорохром, а фермент (пероксидаза из корней хрена);

• реакция учитывается не под микроскопом, а визуально, после добавления в лунку субстрата для данного фермента.

Для объективной оценки результатов ИФА можно использовать простейшие фотометры (ридеры) с вертикальным ходом лучей.

Метод ИФА с использованием индикаторных полосок (иммунохроматография) широко используется в развитых странах для самотестирования. В данном методе используется система ферментных каналов, предусматривающая включение двух ферментов. Эта пара подбирается таким образом, чтобы продукты одной ферментативной реакции служили субстратами для второго фермента. Поверхность индикаторной полоски покрыта антителами против выявляемого антигена. Вместе с антителами на твердой фазе иммобилизованы молекулы фермента глюкозооксидазы. Готовую полоску погружают в исследуемый образец. Антитела связывают молекулы антигена из пробы. Степень заполнения вакантных антител пропорциональна концентрации антигена. Затем индикаторную полоску переносят в раствор, содержащий конъюгат стандартного антигена с пероксидазой, субстрат для глюкозооксидазы (глюкозу) и хромоген (4-хлорнафол).

Глюкозооксидаза катализирует превращение глюкозы в глюконовую кислоту с образованием перекиси водорода. Конъюгат связывается свободными антителами на полоске, и пероксидаза оказывается в непосредственной близости от области наибольшей концентрации перекиси водорода. Атомарный кислород, образующийся в результате ферментативного расщепления перекиси, окисляет хромоген. В результате образуется голубое нерастворимое соединение, которое проявляется на полоске.

Интенсивность развивающейся окраски обратно пропорциональна концентрации определяемого вещества в образце. Регистрацию проводят визуально или с помощью фотометра, предназначенного для измерения отраженного света. Такой вариант иммуноферментного анализа не требует промывок и разделения связанных и свободных молекул конъюгата. Анализируемый материал (сыворотки, слюна, моча) не требует предварительного разведения и дополнительной обработки.

Для упрощения интерпретации полученных результатов в индикаторные полоски вводят внутренний стандарт. На индикаторной полоске в отдельном месте иммобилизуют антитела к пероксидазе. Концентрацию антипероксидазных антител подбирают в такой концентрации, чтобы связанный ими конъюгат пероксидаза-антиген содержал некоторое диагностически значимое количество антигена.

Интенсивность окраски зоны внутреннего стандарта сравнивают с окраской основной части индикаторной полоски. Если таковая превышает зону опытного образца, значит концентрация определяемого вещества больше условной концентрации антигена внутреннего стандарта.

 

МЕТОД ИММУНОБЛОТИНГА

 

Иногда существует необходимость определять антитела к конкретным белкам вируса, то есть спектр специфических антител. Если с этой целью использовать ИФА, то в таком случае придется предварительно из вирусного патогена выделить и очистить необходимые антигены. Полученные белки наносят отдельно на твердую фазу. В случае использования 96-луночного планшета - в каждую лунку по одному виду антигена. Затем определяют специфические антитела непрямым методом ИФА.

По наличию положительной реакции в лунке с тем или иным антигеном можно судить о наличии соответствующих специфических антител. Такого рода иммуноферментные тест-системы предлагаются фирмами-производителями, однако широкое распространение, благодаря большей информативности и простоте исполнения самого исследования, получил метод иммунного блотинга (Western blot).

Иммунный блотинг (ИБ) позволяет определять в сыворотке крови антитела одномоментно и в то же время дифференцированно ко всем диагностически значимым белкам вируса. В переводе с английского Western blot означает западный перенос (дословно - промакивание).

На первом этапе этого метода осуществляют электрофоретическое разделение смеси белков патогена в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН). ДСН, являясь поверхностно активным веществом, равномерно обволакивает молекулы белка и придает всем им отрицательный заряд приблизительно равной величины. Поэтому молекулы движутся в электрическом поле в одном направлении, а скорость продвижения зависит только от размеров молекулы (молекулярной массы) белка.

В результате электрофоретической процедуры получают гелевую пластину, в толще которой в виде отдельных тонких линейных зон располагаются белки. По направлению движения они разделяются в следующем порядке: ближе к старту находятся белки большой молекулярной массы, порядка 120-150 кДа, а к финишу далее всех продвинулись протеины массой 5-10 кДа. На втором этапе гелевую пластину накладывают на лист нитроцеллюлозы и помещают эту конструкцию между электродами источника постоянного тока. Под действием электрического поля белки перетекают из пористого геля на более плотную мембрану, где достаточно прочно закрепляются (рис. 11).

 

 

Полученный блот обрабатывается блокирующим раствором, содержащим индифферентные в антигенном отношении белки и/или неионные детергенты (Твин 20), молекулы которых блокируют на мембране свободные от антигена места. Затем лист мембраны разрезают на узкие полоски таким образом, чтобы каждая полоска содержала все антигенные фракции. Описанные этапы выполняются фирмой-производителем

В коммерческих тест-системах для определения антител методом иммунного блотинга содержатся уже готовые к исследованию блоты (полоски, или стрипы). Пользователь проводит определение всего спектра специфических антител к белкам патогена по схеме непрямого метода. В качестве хромогена для проведения цветной (ферментативной) реакции используют растворимое бесцветное вещество, продукт которого приобретает окраску, становится нерастворимым и оседает (преципитирует) на нитроцеллюлозе.

В результате проведения последовательно иммунных и ферментативной реакций при наличии в исследуемой пробе антител к белкам патогена на блоте появляются темные поперечные полоски, расположение которых находится в зоне определенных белков патогена. Каждая такая полоска свидетельствует о наличии специфических антител к соответствующему антигену. Результат исследования, проведенного методом иммунного блотинга, выдается в виде перечисления антител к конкретным белкам патогена.

Нитроцеллюлозные блоты после проявления могут долго храниться в высушенном виде. Однако интенсивность окраски при этом значительно ослабевает. Для хранения полученной информации в архиве влажные блоты можно фотографировать. С появлением сканеров, позволяющих вводить в память персональных компьютеров графическое изображение блота, задача сохранения результатов упростилась.

 

РАДИОИММУННЫЙ АНАЛИЗ

 

Принцип радиоиммунного анализа (РИА) аналогичен принципу ИФА, но, в отличие от последнего, в качестве метки используют не фермент, а радиоактивный изотоп. Для определения антигенов и антител разработаны многочисленные варианты иммунологического анализа, которые предусматривают использование меченных различным образом реактивов.

Радиоактивное мечение изотопом ¹³¹J, а в последнее время все чаще ¹²⁵J - многократно проверенный и надежный метод. Но реактивы не стабильны в результате радиоактивного распада и опасны для здоровья.

При иммунорадиометрическом определении антигена, в отличие от радиоиммунологического, используются изотопы меченого реагента. Для определения антигена твердую поверхность, например пластиковую, нагружают антителами и добавляют исследуемый раствор. После отмывания количество антигена, связавшегося с пластиком, можно определить, добавляя избыток радиоактивно меченных антител. Специфичность метода повышается при использовании «твердофазных» и меченых антител, направленных к разным участкам антигена.

 

ДИАГНОСТИКА ИММУНОПАТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ

 

Изучение функционирования иммунной системы человека проводится при аллергических и аутоиммунных заболеваниях, иммунодефицитах с целью иммунодиагностики, т. е. идентификации нарушенного звена иммунитета, мониторинга для прогнозирования исхода заболевания, выбора метода лечения и оценки его эффективности.

Р. В. Петровым в 1984 г. предложен двухэтапный подход к изучению иммунного статуса больных и здоровых людей.

На первом этапе с помощью простых ориентировочных методов выявляют «грубые» дефекты в фагоцитозе, клеточном и гуморальном иммунитете. К таким тестам относятся определение абсолютного и относительного количества Т- и В-лимфоцитов в периферической крови, уровней основных классов иммуноглобулинов (G, А, М), фагоцитарной активности лейкоцитов.

К методам второго уровня относятся тесты, с помощью которых изучается функциональное состояние иммунокомпетентных клеток - естественных киллеров, Т- и В-клеток, функциональная активность фагоцитов. Тесты второго уровня называют аналитическими.

Экспертами ВОЗ предложен подход, который включает следующие методы по изучению иммунного статуса:

 

А.Иммунохимигеские исследования:

• Количественная и качественная оценка иммуноглобулинов, фрагментов иммуноглобулинов, иммунных комплексов.

• Определение цитокинов и растворимых рецепторов для цитокинов.

• Определение продуктов эффекторных клеток и воспалительных реакций.

• Определение компонентов комплемента.

• Определение белков острой фазы.

• Определение других белков.

Б. Клетогные исследования:

• Определение субпопуляций лимфоцитов и фенотипических маркеров, характеризующих изменения функционального состояния клеток.

• Определение клональности лимфоидных клеток.

• Определение функциональной активности лимфоцитов in vitro, пролиферативного ответа, продукции иммуноглобулинов.

• Определение цитотоксичности лимфоцитов и других эффекторных клеток.

• Оценка функциональной активности макрофагов и нейтрофилов.

• Оценка функциональной активности тучных клеток, базофилов, эозинофилов.

 

В. Иммуногистологигеские исследования.

 

Г. Иммуногенетигеские исследования:

• HLA-типирование.

• Фенотипическое и генотипическое определение аллотипов сывороточных белков.

• Пренатальная диагностика и изучение наследования генетических детерминированных дефектов иммунной системы.

 

Контрольные вопросы:

1. Сущность метода флюоресцирующих антител, каково его назначение.

2. Иммуноферментный анализ и для чего его применяют.

3. Что такое метод иммунодлотинга и какоко его назначение.

4. Радиоиммунный анализ и его применение в медицине.

5. Как и для чего проводят диагностику иммунопатологических состояний.

 

Занятие 8