Агглютинационные тесты

Реакция агглютинации (РА) основана на взаимодействии поверхностных антигенов бактерий и других корпускулярных частиц с антителами и протекает в две фазы:

1) специфическая фаза - связывание детерминантной группы (эпитопа) антигена с паратопом - активным центром иммуноглобулина (невидимая фаза);

2) неспецифическая (видимая) фаза - образующийся комплекс (АГ + AT) утрачивает растворимость и выпадает в осадок в виде хлопьев. Однако это явление возможно лишь в электролитной среде, например, в 0,85 % растворе натрия хлорида.

Реакцию агглютинации можно применять для обнаружения специфических антител в сыворотке крови и, наоборот, при помощи стандартной агглютинирующей сыворотки можно идентифицировать выделенные микроорганизмы.

В ветеринарной и медицинской практике серологические реакции как методы диагностики инфекционных болезней применяются для:

1) определения, выявления (качественное и количественное) антител в сыворотке животного с помощью заведомо известного антигена;

2) определения специфического антигена с использованием заведомо известных специфических гипериммунных сывороток (сибиреязвенная, сальмонеллезные, бруцеллезные и др.), установления видовой (вариантной) принадлежности возбудителя болезни, выделенного из исследуемого материала (се­рологическая идентификация).

Серологические реакции применяют также для оценки естественно и искусственно приобретенного организмом животного иммунитета. Серологические реакции ставят на физиологическом растворе NaCl потому, что вторая фаза их протекает в слабоэлектролитной среде.

Реакция агглютинации проявляется в том, что при добавлении сыворотки крови, содержащей специфические антигену антитела, к равномерной взвеси клеток антигена (например, бактерий) происходит их склеивание, образова­ние глыбок, комочков, хлопьев, которые постепенно оседают на дно пробирки, формируя характерный осадок (агглютинат), а жидкость над осадком просветляется. Характер агглютината зависит от антигенного строения микробной клетки. Если антигеном является взвесь неподвижных бактерий (без жгутиков), имеющих только соматический 0-антиген, образуется мелкозернистый осадок в течение 16-22 ч. Если антигеном служит взвесь подвижных бактерий (со жгутиками) и в агглютинации участвует наряду с соматическим еще жгутиковый Н-антиген, формируется крупнохлопчатый, крупнозернистый агглютинат. В ветеринарной практике РА используют для диагностики бруцеллеза, лептоспироза, кампилобактериоза, сальмонеллеза, типизации возбудителя колибактериоза и др.

Существует несколько методов постановки РА: пробирочный (объемный), капельный (на стекле), антиглобулинавый тест (реакция) Кумбса, метод адсорбции агглютининов (РА по методу Кастеллани), кольцевая реакция с молоком (КР), реакция гемагглютинации (ее разновидности).

Для определения антител в сыворотке крови (по известному антигену) сначала берут кровь (5-10 мл) из яремной вены животного (у свиней из хвостовой) в стерильные пробирки и ставят в теплое место. После образования сгустка его осторожно отделяют от стенок пробирки, обводят стерильной металлической проволокой (можно вязальной спицей) и ставят в холодное место для ретракции. Сыворотку отсасывают в стерильные пробирка, последние нумеруют и отправляют с нарочным и сопроводительным письмом в лабораторию. В РА (как и вообще при серологических исследованиях) используют или свежие сыворотки без гемолиза, или консервированные фенолом, мертиолатом, борной кислотой.

Антиген для РА представляет собой взвесь в физиологическом растворе убитых или живых бактерий. Для диагностических целей необходимо пользоваться стандартным антигеном. Если же требуется идентифицировать бактериальную культуру, выделенную из патологического материала, применяют стандартные сыворотки, а антиген готовят из суточной культуры - смыв с МПА.

Специфические стандартные агглютинирующие сыворотки получают на биофабриках путем гипериммунизации животных соответствующим антигеном (специально под готовленной взвесью живых или убитых микробов, эритроцитами и др.) Готовую сыворотку консервируют, разливают в ампулы и запаивают. Нередко диагностические сыворотки подвергают лиофильному высушиванию. Перед употреблением их разводят дистиллированной водой.

Классический (пробирочный) метод РА (Рис 1.). Исследуемые сыворотки разводят в чистых сухих пробирках. Для каждой сыворотки нужна отдельная пипетка. В зависимости от вида диагностируемого заболевания готовят соответствующие степени разведения сывороток (согласно инструкции). Это объясняется различным содержанием в сыворотке нормальных антител (у разных видов животных). Например, для диагностики бруцеллеза сыворотки разводят 1 : 25, 1 : 50, 1 : 100, 1 : 200, 1 : 400. Удобно делать разведения следующим образом. В отдельной пробирке готовят исходное (основное) разведение сыворотки - 1 : 25, смешивая 0,1 мл испытуемой сыворотки с 2,4 мл физиологического раствора. В опытные пробирки наливают по 1 мл физраствора NaCl. Затем из пробирки с основным разведением сыворотки 1 мл ее переносят в первую опытную пробирку, смешивают с физраствором (разведение становится 1 : 50) и 1 мл переносят во вторую про­бирку (1 : 100), из второй - в третью 1 мл и т. д. Из последней пробирки 1 мл выливают в сливную чашку, чтобы в каждой пробирке осталось по 1 мл разведенной сыворотки (рис. 51). Во все пробирки добавляют по две капли стандартного антигена (концентрация 10 млрд микробных тел в 1 мл), смешивают встряхиванием и выдерживают в термостате 4-6 ч (37 °С), а затем при комнатной температуре 14-16 ч.

При постановке РА (как и при каждой серологической реакции) обязательны контроли: в тех же разведениях испытывают нормальную сыворотку (от заведомо здорового животного) и позитивную (от заведомо больного животного или стандартную биофабричного производства) с тем же антигеном.

Для контроля антигена с целью исключения самоагглютинации в 1 мл физраствора добавляют две капли антигена.

В настоящее время пробирочный метод РА часто осуществляют в объеме 1 мл; сыворотку и антиген, разведенные до определенной концентрации, вносят в пробирки по 0,5 мл. Данную модификацию РА используют

преимущественно с целью выявления специфических антител в сыворотке крови при серологической диагностике болезней животных (например, бруцеллеза, сальмонеллеза и др.).

Техника постановки РА заключается в следующем.

1. В штатив ставят пять пробирок в ряд. Количество рядов пробирок зависит от количества проб сывороток, поступивших для исследования. Пробирки надписывают (нумеруют) карандашом по стеклу.

2. Готовят основное разведение каждой испытуемой сыворотки, а

также контрольных - позитивной и нормальной сывороток. Для этого в первую пробирку ряда вносят 2,4 мл физраствора NaCl и добавляют 0,1 мл сыворотки (получается разведение 1 : 25).

3. Готовят рабочие разведения каждой пробы сыворотки: в третью, четвёртую и пятую пробирки всех рядов вносят по 0,5 мл физраствора. Затем из первой пробирки мерной пипеткой (с помощью «груши») переносят во вторую и третью пробирки по 0,5 мл основного разведения сыворотки. В третьей пробирке внесенную сыворотку смешивают с находящимся в ней физраствором (получается разведение 1 : 50). Из третьей пробирки 0,5 мл сыворотки переносят в четвертую, смешивают (разведение становится 1 : 100) и 0,5 мл переносят в пятую пробирку (разведение 1 : 200). Из последней пробирки 0,5 мл разведенной сыворотки выливают в банку с дезраствором. Таким образом, во второй, третьей, четвертой и пятой пробирках осталось по 0,5 мл сыворотки крови, разведенной соответственно 1,: 25, 1 : 50, 1 : 100 и 1 : 200, то есть получили последовательные двукратные разведения каждой пробы сыворотки.

4. В пробирки с разведенными сыворотками вносят антиген, предварительно разведенный физраствором NaCl до нужной концентрации (единый бруцеллезный антиген разводят 1 : 10 - 1 млрд. микробных тел в 1 мл), вносят его градуированной пипеткой в количестве 0,5 мл в каждую пробирку. В результате конечные разведения сыворотки становятся в 2 раза больше (концентрация в 2 раза меньше) - соответственно 1 : 50, 1 : 100, 1 : 200, 1 : 400, а в каждой опытной пробирке общий объем компонентов составляет 1 мл. В первую пробирку антиген не добавляют, она служит контролем качества испытуемой сыворотки.

Компоненты при постановке РА вносят в пробирки отдельными (индивидуальными) мерными пипетками (пользуясь резиновыми грушами) или групповыми дозаторами (пипетки Флоринского, рис. 2 и 3).

После добавления к испытуемым и контрольным сывороткам антигена штативы с пробирками осторожно встряхивают и помещают в термостат на 16-20 ч (37-38 ⁰С), затем 1-2 ч выдерживают при комнатной температуре, после чего учитывают реакцию агглютинации.

 

 

 

Рис. 2. Одиночная автоматическая пипетка Флоринскаго: а — стеклянный патрубок; б — расширение для сбора избыточной жидкости; в — резиновая груша; г — пипетка-мерник,

 

 

Рис. 3. Групповая автоматическая пипетка Флоринского:

а — стеклянный цилиндр; б — отверстия в нижней части цилиндра; в — пипетки-мерники; г — приемник для избыточной жидкости; д — отверстие для слива избыточной жидкости; е (веер-хд) — резиновая груша.

 

Учет РА проводят невооруженным глазом (визуально) или с помощью агглютиноскопа (рис. 4) в каждой пробирке, начиная с контрольных. При наличии хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних примесей в первой пробирке опытного ряда РА не учитывают.

 

-

Рис. 4, Агглютиноскоп,

. Результаты РА определяют в крестах по следующей схеме:

++++(#) - полное просветление жидкости над полностью осевшим на дно пробирки агглютинатом в виде раскрытого перевернутого белого кружевного зонтика. При встряхивании зонтик разбивается на хлопья и комочки, а жидкость остается прозрачной. Принято считать, что произошла 100 %-ная агглютинация (рис. 5);

 

 

1 2 3 4

Рис. 5. Реакция агглютинации:

 

пробирочный метод (1 и 2 - отрицательная; 3 и 4 - положительная); капельный (пластинчатый) метод (А - отрицательная; Б - положительная).

 

+++ (+++) - неполное просветление жидкости, но хорошо выраженный зонтик (75 %-ная агглютинация). При встряхивании агглютинат разбивается на хлопья, комочки, глыбки; жидкость слегка мутноватая;

++ (два креста) - заметное просветление жидкости, зонтик умеренно

выражен (50 %-ная агглютинация), при встряхивании осадок разбивается на более мелкие глыбки и комочки, жидкость мутная;

(+) - едва заметное просветление жидкости, зонтик слабо выражен, при встряхивании осадок разбивается на небольшое количество хлопьев и комочков (25 %-ная агглютинация), жидкость явно мутная;

- (минус) - просветление жидкости и образование зонтика отсутствуют, на дне пробирки в центре виден «пунктик» или «пуговка» - компактный осадок клеток (микробов) антигена, которые при встряхивании разбиваются в равномерную мутную взвесь.

Показатели агглютинации в пробирках на два, три или четыре креста характеризуются как положительная реакция. Последнее разведение сыворотки, в котором наблюдается агглютинация с оценками на два, три и четыре креста, считают ее титром. Диагностическую оценку реакции агглютинации проводят с учетом выраженности в крестах и по высоте ее титров (при различных болезнях по-разному.

Ориентировогная реакция агглютинации (Капельный меод РА)для идентификации микроба служит для предварительного определения вида микроба. На стекло наносят каплю узкоспецифичной адсорбированной сыворотки (содержащей только специфические антитела). Сыворотку наносят в разведении 1:100 и рядом - каплю физиологического раствора (контроль). Исследуемую культуру микроба петлей вносят в обе капли и размешивают. Через 2-4 мин учитывают результат. При положительной реакции (соответствии исследуемой культуры диагностической сыворотке) наблюдается скучивание бактерий в виде хлопьев на фоне прозрачной жидкости. В контроле - равномерная муть (рис. 6). Реакцию ставят перед постановкой развернутой РА для идентификации микроба.

Кровекапельный метод РА (ККРА) чаще применяют для диагностики пуллороза (сальмонеллеза) и респираторного микоплазмоза птиц. На обезжиренное предметное стекло наносят каплю цельной крови (взятой у птицы из гребешка или сережки), в нее добавляют каплю стандартного антигена и смешивают стеклянной палочкой. Для получения видимости феномена агглютинации биопромышленность выпускает подкрашенный микоплазмозный антиген. Для диагностики сальмонеллеза птиц с помощью кровекапельной реакции непрямой гемагглютинации (ККРНГА) - пуллорный эритроцитарный антиген. В положительных случаях ККРА (когда в крови имеются специфические антигену антитела) через 30-60 с в капле смеси появляются глыбки, хлопья склеенного антигена (агглютинат).

Пластинчатая Роз-бенгаловая проба (РБП) - разновидность методики РА, рекомендована и разработана для диагностики бруцеллеза, поэтому будет описана в соответствующем разделе частной микробиологии.

Кольцевая реакция (проба) с молоком. В основном ее используют при обследовании крупного рогатого скота на бруцеллез и при контроле сборного молока. В агглютинационные пробирки наливают по 2-3 мл свежего цельного молока и добавляют антиген (окрашенный гематоксилином) по 0,2 мл (2 капли). Пробирки встряхивают до равномерного окрашивания молока, выдерживают в водяной бане (или термостате) при 37 °С 45-60 мин. Если в молоке имеются антитела, специфические бруцеллезному антигену, образуется комплекс антиген - антитело, который адсорбируется на капельках жира и при отстаивании всплывает наверх, образуя синее кольцо в нижнем слое сливок; столбик молока обесцвечивается. Отрицательная реакция характеризуется синей окраской всего молока в пробирке и слегка желтоватым слоем сливок.

Реакция агглютинации методом адсорбции антител (по Кастеллани). У бактерий отдельных видов наряду со специфическими видовыми антигенами имеются еще групповые, общие с другими видами одного рода или семейства микроорганизмов. При введении в организм животного (и человека) таких бактерий (например, сальмонелл) образуются антитела как против видоспецифических, так и групповых (общих разным видам) антигенов. Если в реакции участвует микроб, обладающий групповыми и типовыми антигенами, то происходит полная агглютинация - общих (групповых) и типоспецифических антигенов, при этом из сыворотки все антитела адсорбируются. Если антиген не типоспецифичен антителам, происходит реакция агглютинации за счет только групповых антигенов и групповых антител, типоспецифические антитела в сыворотке остаются. Адсорбированные групповые антитела удаляют: сыворотки с групповым агглютинатом центрифугируют, надосадочную жидкость (сыворотку с оставшимися типоспецифическими антителами) осторожно отсасывают в чистую пробирку и вновь используют в РА. Так как сыворотка, истощенная групповыми антигенами, содержит только специфические антитела, она будет реагировать положительно лишь со специфическим антигеном. На этом принципе основан метод получения монорецепторных (диагностических) сывороток в биологической промышленности.

 

В серологической диагностике имеются еще варианты постановки РА - реакция микроагглютинации, когда результат учитывают в раздавленной капле жидкости на предметном стекле под микроскопом. Каплю пипеткой берут из пробирки, в которой соединены сыворотка и антиген. Практическое применение эта реакция нашла в диагностике лептоспироза, где и будет описана.

Реакция Кумбса. В ряде случаев при постановке РА (и РСК) происходит явление прозоны - отрицательный результат в малых разведениях позитивных сывороток. Это объясняется наличием в организме больных животных неполных (блокирующих) антител, которые тормозят образование агглютината (РА) или взаимодействие полных антител с антигеном в РСК. Неполные антитела термостабильны - нагревание 10 мин при 70 °С не разрушает их (полные антитела при этих же условиях инактивируются). Неполные антитела существуют независимо от полных, выполняя те же функции. Эффективным методом выявления неполных антител является метод (реакция) Кумбса. Основан он на применении антиглобулиновой сыворотки, служащей посредником для соединения неполных антител, фиксированных на корпускулярных антигенах (эритроциты, бактерии). Антиглобулиновую сыворотку получают иммунизацией кроликов сывороткой крови или белками глобулиновой фракции того вида животного, у которого исследуют неполные антитела.

Существует два варианта постановки реакции Кумбса.

• Прямая реакция заключается в том, что используют отмытые сенсибилизированные эритроциты исследуемого больного животного (или иммунизированного). На поверхности эритроцитов адсорбированы неполные антитела. К ним добавляют антиглобулиновую сыворотку (содержащую антитела против глобулинов), происходит агглютинация эритроцитов.

• Непрямая реакция Кумбса отличается тем, что исследуют не эритроциты, а сыворотку больного (содержащую неполные антитела), добавляют эритроциты здорового животного (для абсорбции ими неполных антител) и, как в прямом методе, антиглобулиновую сыворотку. Блокирующие (неполные) антитела соединяются с эритроцитами, а антиглобулиновая сыворотка вступает в реакцию с неполными антителами - происходит агглютинация эритроцитов, нагруженных неполными антителами. Антиглобулиновую сыворотку готовит биопромышленность. Выпускают ее в сухом лизированном) виде.

В ветеринарии реакция Кумбса разработана для диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота в виде бактериального врианта.

Методика постановки реакции Кумбса. Компоненты реакции: бруцеллезный антиген (отмытый физраствором 2-3-кратным центрифугированием), испытуемая сыворотка крупного рогатого скота, антиглобулйновая сыворотка. Предварительно ставят обычную РА в четырех разведениях исследуемой сыворотки 1 : 50-1 : 400. Учитывают результат, затем определяют предельный титр. Пробирку с сывороткой предельного титра отставляют, а содержимое следующих пробирок исследуют на наличие неполных антител: в эти пробирки добавляют по 2 мл физраствора, содержимое каждой пробирки переносят в центрифужные пробирки, центрифугируют при 4000 об/мин, надосадочную жидкость удаляют, осадок ресуспендируют. 2 мл физраствора вновь центрифугируют при тех же условиях. После второго отмывания и удаления надосадочной жидкости осадок ресуспендируют в 1 мл антиглобулиновой сыворотки (в рабочем титре), смесь помещают в термостат на 18 ч (37 °С), затем оставляют на 2-4 ч при комнатной температуре, после чего учитывают результат, как при обычной РА. Минимальный рабочий титр реакции Кумбса при бруцеллезе крупного рогатого скота учитывается 1 : 200. Титр 1 : 100 считается сомнительным результатом.

 

Реакция непрямой гемагглютинации (РИГА) является своеобразной модификацией РА. Сущность ее состоит в том, что молекулы антигена адсорбируются на поверхности эритроцитов. Такие «нагруженные» антигенами эритроциты приобретают способность агглютинироваться иммунной сывороткой, специфичной для данного антигена. Эритроциты склеиваются и выпадают в осадок, образуя на дне пробирки гемагглютинат в виде перевернутого зонтика. В последнее время РНГА получила широкое распространение благодаря высокой чувствительности и методической простоте постановки.

В реакции латекс-агглютинации (РЛА) в качестве носителей антигенов или антител можно использовать частицы полистирольного латекса, которые служат носителями антигена и при образовании иммунных агрегатов играют роль «мостиков» между молекулами антител. Латексные частицы являются как бы искусственными эритроцитами, но более устойчивыми к внешним воздействиям. Каплю суспензии такого латекса прибавляют к капле исследуемой сыворотки, затем тщательно перемешивают. При положительной реакции образуются мелкие, но хорошо видимые невооруженным глазом агглютинаты.

Реакция коагглютинации (РКА) основана на том же принципе, что и реакция латекс-агглютинации, но в качестве носителя используется белок А некоторых штаммов золотистого стафилококка, который способен неспецифически адсорбировать на своей поверхности Fc-фрагменты иммуноглобулина G. Получившаяся молекула способна агглютинировать гомологичные антигены. Учитывая тот факт, что белок А адсорбирует не все подклассы иммуноглобулина G, в последние годы для этой цели используют белок G стрептококков.

Помимо частиц латекса и белка А в реакциях «антиген - антитело» могут быть использованы и другие инертные носители (бентонит, каолин, активированный уголь и др.).

 

Контрольные вопросы.

1. Антигенное строение микробной клетки.

2. Различие антител по проявлению их действия in vitro.

3. Чувствительность и специфичность серологических реакций.

4. Компоненты, техника постановки пробирочной РА, ее учет.

5. Сущность и техника постановки капельной РА и кольцевой реакции с молоком.

6. Сущность реакции Кумбса.

7. Отличие прямой и непрямой реакции Кумбса, отличие бактериального варианта реакции.

8. Назначение антиглобулиновой сыворотки.

А н я т и е 5.