Тема «МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ИММУНИТЕТА»
Цель занятия: 1. Ознакомиться с методами исследования показателей иммунитета. 2. Освоить методику визуального подсчета лейкоцитов и определения лейкограммы.
Методические указания: В качестве показателей иммунитета исследуют в цельной крови общее количество лейкоцитов, в том числе лимфоцитов. Идентифицируют среди них Т- и В-лимфоциты, а в сыворотке крови определяют содержание иммуноглобулинов различных классов. Кровь для исследования берут у крупного рогатого скота из яремной вены. Для получения цельной крови предварительно в пробирки вносят антикоагулянт – 100-200 ед. гепарина на 10 мл крови. Для получения сыворотки пробирки с кровью помещают в термостат (37 °С) на 30 мин, после чего сгусток отделяют с помощью спицы из нержавеющей стали. После этого пробирки с сывороткой крови устанавливают в штатив и помещают в холодильник (4 °С) на 6-8 ч. В дальнейшем сыворотку переливают в пенициллиновые флаконы, закрывают пробками, хранят при температуре -20...- 40 0С до ее использования.
Задание 1.Визуальный метод подсчета лейкоцитов и определения лейкограммы.
Материалы и оборудование: кровь с антикоагулянтом, камера Горяева, покровные стекла, пробирки, штатив, градуированные пипетки, резиновые груши, микроскоп, иммерсия, 3%-ный раствор уксусной кислоты, подкрашенный метиленовым синим, метанол или этанол, раствор красителя по Романовскому-Гимзе, плакаты с цветными рисунками форменных элементов крови животных.
Количество лейкоцитов подсчитывают в камере Горяева. Для этого в пробирку вносят 0,4 мл (0,38 мл) разводящей жидкости и 0,02 мл исследуемой крови. Получают разведение 1:20. В качестве разводящей жидкости используют 3%-ный раствор уксусной кислоты, подкрашенный метиленовым синим (уксусная кислота лизирует эритроциты, метиленовый синий окрашивает ядра лейкоцитов). Перед заполнением камеры Горяева пробирку с разведенной кровью тщательно встряхивают. Чистое сухое покровное стекло притирают к камере до появления радужных колец. Каплю крови наносят к краю шлифовального стекла камеры. Поскольку лейкоцитов гораздо меньше, чем эритроцитов, и на большой квадрат их приходится 1-2, то для точности подсчет производится в 100 больших квадратах (1600 малых). Расчет производят по формуле:
А4000 • 20 Х = ----------------------
где X- количество лейкоцитов в 1 мкл крови; А - количество лейкоцитов, подсчитанных в 100 больших квадратах; 4000 - множитель, приводящий результат к объему 1 мкл крови, так как объем одного малого квадрата составляет 1/4000 мкл; 20 - разведение крови; 1600 - количество малых квадратов.
Пример. В 100 больших квадратах (1600 малых) подсчитали 159 лейкоцитов. Помня о том, что объем одного малого квадрата равен 1/4000 мм3, а кровь разведена в 20 раз, подсчитывают количество лейкоцитов в 1 мкл крови:
159 • 4000 • 20 Х=----------------------- = 7950
Практически (при условии соблюдения указанных правил разведения и подсчета) для получения действительного содержания лейкоцитов в 1мкл достаточно полученную при подсчете сумму разделить пополам и умножить на 100. Лейкоформулу определяют посредством дифференциального подсчета форменных элементов белой крови на мазках. Мазки готовят общепринятым способом. После высушивания при комнатной температуре их по краю подписывают мягким простым карандашом и фиксируют 5 мин в метаноле или 20 мин в этаноле. Мазки окрашивают в течение 20-40 мин свежеприготовленным раствором красителя по Романовскому - Гимзе (2-3 капли основного раствора красителя на 1 мл воды), затем их промывают водой, сушат и исследуют под микроскопом (масляная или глицериновая иммерсия, объектив Х90 окуляр Х7-10. Дифференциацию клеток проводят, сопоставляя форму, размер и окраску клеток с рисунками форменных элементов крови животных, приведенных в специальных цветных таблицах. Подсчитывают 100-200 клеток и определяют относительное содержание каждого типа клеток в процентах. Затем рассчитывают абсолютное содержание лимфоцитов лимфоцитов крови по формуле: А = О • X,
Где: А - абсолютное количество лимфоцитов в крови, тыс/мкл; О - относительное количество лимфоцитов, определенное по формуле, %; X- количество лейкоцитов в крови, тыс/мкл.
Задание 2. Поставить реакцию торможения миграции агармиграционным тестом Материалы и оборудование:пластиковые или стеклянные чашки диаметром 50 мм; пробойники для агара диаметром 2,5 мм; проекционный аппарат «Микрофот» типа 5ПО-1; агар-агар; трис-хлористый буфер (рН 7,3); среда 199; сыворотка крупного рогатого скота; гепарин; антибиотики (для консервации), не токсичные для клеток. Реакция миграции лейкоцитов.
Принцип метода. Подвижность лейкоцитов периферической крови, их миграция к очагам тканевой деструкции, хемотаксис к ауто- и гетероантигенам, перераспределение между лимфоидными органами при стрессорноадаптивных реакциях являются составляющей компонентой общей системы реактивности, способности к сохранению постоянства внутренней среды. Сенсибилизированные к определенному антигену лимфоциты резко снижают скорость подвижности в среде, в которую вносят этот антиген. Реакция осуществляется при непосредственном взаимодействии антигенспецифических рецепторов с антигеном, а также через воздействие фактора, ингибирующего миграцию клеток и выделяющегося при контакте со специфическим антигеном. Этот феномен позволяет продемонстрировать органоспецифическую клеточно-опосредованную чувствительность. Реакция торможения миграции агармиграционным тестом. Ход определения. 3%-ный агар-агар в изотоническом растворе натрия хлорида, забуференном трихлоридным буфером (рН 7,3), охлажденном до 50 °С, добавляют в 10 мл смеси: 9 мл среды 199, 1 мл сыворотки крупного рогатого скота, 3000 ЕД мономицина (смесь предварительно прогревают до 37 °С). Полученный гель разливают в чашки (если используются стеклянные, то их следует силиконировать), установленные строго горизонтально в количестве, необходимом для создания слоя толщиной 2 мм. В затвердевшем геле пробивают лунки (2,5мм) в количестве, обусловленном эпытом. Концентрацию антигена, которую нужно внести в смесь, высчитывают опытным путем (по дозе, вызывающей наименьший разброс в повторных постановках) для каждого антигена и серии опытов. Выделение лейкоцитов. В пробирку помещают 10 мл гепаринизированной крови обследуемого животного (25 ЕД гепарина на 1 мл крови). В течение 1 ч пробирку выдерживают в термостате при 37 °С под углом 45°. Через 50 мин пробирки переводят в вертикальное положение и выдерживают еще 10 мин. После отстаивания плазму осторожно отсасывают и переносят в центрифужную пробирку. Центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют. Примесь эритроцитов в клеточном осадке лизируют в гипотоническом растворе натрия хлорида, для чего к клеточному осадку добавляют 5 мл 0,35 %-ного раствора натрия хлорида и осторожно пастеровской пипеткой ресуспендируют клетки, не допуская образования пены, в течение 30-45 с. После экспозиции к суспензии клеток немедленно добавляют 0,6 мл 5%-ного раствора натрия хлорида и тщательно перемешивают. В результате раствор становится изотоничным. Полученную взвесь лейкоцитов трижды отмывают средой 199 или фосфатным буфером (рН 7,4). Контрольные и опытные исследования проводят в четырех параллельных лунках, внося в каждую из них по 5 мкл ресуспендированной взвеси лейкоцитов (1,5 млн клеток). Через 20 ч инкубации чашек в термостате при 37 0С их заливают 10%-ным раствором формалина (в целях фиксации клеток). Через 4 ч слой агара осторожно удаляют, чашки промывают и высушивают. Результаты учитывают путем проектирования полей миграции на бумаге с помощью аппарата «Микрофот». Индекс миграции
D20 – d20 И = -----------------, D2к – d2к
Где: D20 - средний диаметр четырех зон миграции в опыте; D2к - средний диаметр четырех зон миграции в контроле; d20 - средний диаметр четырех центральных лунок в опыте; d2к - средний диаметр четырех центральных лунок в контроле.
Контрольные вопросы: 1.Визуальный метод подсчета лейкоцитов и определения лейкограммы и ее значение. 2.Реакция миграции лекоцитов – принцип метода 3.Получение и подготовка крови для оценки иммунитета макроорганизма.
Популярное: Организация как механизм и форма жизни коллектива: Организация не сможет достичь поставленных целей без соответствующей внутренней... Модели организации как закрытой, открытой, частично открытой системы: Закрытая система имеет жесткие фиксированные границы, ее действия относительно независимы... Как вы ведете себя при стрессе?: Вы можете самостоятельно управлять стрессом! Каждый из нас имеет право и возможность уменьшить его воздействие на нас... ©2015-2020 megaobuchalka.ru Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. (480)
|
Почему 1285321 студент выбрали МегаОбучалку... Система поиска информации Мобильная версия сайта Удобная навигация Нет шокирующей рекламы |