Капельный метод РА на предметном стекле

 

Его в основном применяют для быстрого определе-

ния вида, для идентификации культур бактерий, а так-

же для установления принадлежности к определенным

серогруппам. Рассмотрим методику постановки РА на

предметном стекле на примере определения вида саль-

монелл.

Для постановки РА на предметном стекле необходи-

мы следующие компоненты.

1. Чистая, суточная культура неизвестного вида бак-

терий на косом МПА в пробирке, по морфологическим,

культуральным и ферментативным свойствам предва-

рительно должна быть отнесена к бактериям семейства

Enterobacteriaceae (т. е. у изучаемой культуры уже из-

учили первые 5–7 признаков).

2. Антительный диагностикум — набор поливалент-

ных и монорецепторных О- и Н-агглютинирующих саль-

монеллезных сывороток в фабричной упаковке с этикет-

ками, с инструкцией.

3. Пробирка с физраствором рН 7,2–7,4 с пипеткой.

Капельную РА на предметном стекле для определе-

ния родовой и видовой принадлежности сальмонелл ста-

вят по следующей методике в три этапа.

1-й этап. Для определения родовой принадлежности

сальмонелл на предметное стекло наносят каплю по-

ливалентной сальмонеллезной агглютинирующей сы-

воротки и отдельно каплю физиологического раствора

(для исключения самоагглютинации). В каждую каплю

вносят часть снятой с агара колонии, которую, начиная

с периферии капли, тщательно растирая до гомоген-

 

взвесь подогревают над пламенем спиртовки до 37С (не

более!). Если сыворотка и бактериальная культура друг

другу специфичны, то через 2–3 мин происходит агглю-

тинация бактериальных клеток — бактерии склеива-

ются в виде хлопьев, реакционная жидкость при этом

просветляется. В зависимости от того, подвижная куль-

тура или без жгутиков, агглютинат будет иметь разный

СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ

371

 

вид: подвижные виды бактерии образуют крупные хло-

пья агглютината (Н-агглютинация), а неподвижные —

мелкие комочки (О-агглютинация). Контрольная кап-

ля с физиологическим раствором должна оставаться

равномерно мутной.

2-й этап. После определения родовой принадлежно-

сти переходят к определению серогруппы сальмонелл.

Для этого необходимо поставить РА на предметном сте-

кле с О-агглютинирующими сыворотками серогрупп А,

В, С, D, E по методике описанной выше. На предметное

стекло наносят по капле сыворотки всех серогрупп, и в

каждую каплю вносят часть колонии изучаемой куль-

туры по вышеописанной методике. Положительная

РА должна получиться только в одной капле, напри-

мер с сывороткой серогруппы С, а в нее входят виды

S. choleraesuis и S. typhisuis.

3-й этап. Для окончательного определения вида саль-

монелл необходимо продолжить исследование и поста-

вить РА на предметном стекле c Н-агглютинирующими

сальмонеллезными сыворотками, которые входят в фа-

бричный набор сывороток.

 

ЗАДАНИЯ

ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

 

1. Познакомиться с фабричными компонентами для

постановки РП: гипериммунной преципитирующей си-

биреязвенной сывороткой и сибиреязвенным антигеном.

2. Освоить методику постановки РП с положительно

и отрицательно реагирующим кожевенным сырьем ме-

тодом наслаивания. Провести учет результатов реакции

преципитации, поставленной методом наслаивания и

оценить качество сырья.

3. Поставить РА на предметном стекле для идентифи-

кации сальмонеллезной культуры при помощи полива-

лентной и О- и Н-агглютинирующими сальмонеллезны-

ми сыворотками.

372

ТЕМА 10

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

 

1. Понятие об антигенах и антителах.

2. С какой целью применяются серологические реакции?

3. Какие изменения происходят с антигеном под действием

специфических антител в РА, в РП?

4. Какие видимые проявления реакции появляются при по-

ложительной и отрицательной РА?

5. Какие видимые проявления реакции появляются при по-

ложительной и отрицательной РП?

Тема 11

 

ПРИНЦИП ПРИГОТОВЛЕНИЯ
БИОПРЕПАРАТОВ. ВАКЦИНЫ,

ГИПЕРИММУННЫЕ СЫВОРОТКИ
И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА

 

Цель занятия. Ознакомить студентов с принципами приго-

товления биологических препаратов, применяемых в ветери-

нарной практике: вакцинами, лечебно-профилактическими и

диагностическими сыворотками, антигенами, аллергенами, а

также методами контроля их качества.

Материалы и оборудование. Вакцины против сибирской

язвы, туберкулеза, бруцеллеза, лептоспироза, ботулизма.

Лечебно-профилактические иммунные сыворотки, диагно-

стические агглютинирующие сыворотки и антигенные ди-

агностискумы, диагностические аллергены — бруцеллин,

туберкулин.

 

Вакцины — это биологические препараты, содержа-

щие микроорганизмы или продукты их жизнедеятель-

ности, которые применяют для активной иммунизации

с целью создания иммунитета (невосприимчивости)

организма к определенным инфекционным болезням.

Различают вакцины живые и инактивированные (кор-

пускулярные), а также химические и анатоксины (не-

корпускулярные).

374

ТЕМА 11

 

Живые вакцины представляют собой взвесь бакте-

рий, приготовленных из аттенуированных возбудите-

лей, ослабленных ультрафиолетовыми лучами, дли-

тельным выращиванием на искусственных питательных

средах иногда в присутствии ингибитора и т. д. В резуль-

тате целенаправленного воздействия микроорганизмы,

потеряв вирулентность, должны сохранить антигенные

и иммуногенные свойства.

Убитые вакцины обычно готовят из взвеси виру-

лентных и иммуногенных штаммов бактерий, поэтому в

процессе приготовления вакцин их инактивируют. Для

инактивирования бактерий используют высокую темпе-

ратуру или химические вещества, в основном применя-

ют формалин, добавляя от 0,2 до 0,5%, в зависимости

от биологических особенностей микроорганизмов. Вы-

ращивание бактериальной массы для живой и убитой

вакцины проводят в жидкой обогащенной питательной

среде в котлах-реакторах, аэрируемых подаваемым кис-

лородом. После накопления максимальной концентра-

ции бактериальная масса отделяется от жидкой части

путем центрифугирования. Полученная бактериальная

масса служит основой для получения вакцин. Концен-

трацию бактерий в 1 мл готовой вакцины доводят до

4 млрд при помощи стандартного эталона мутности, фо-

тометрически подогнанного к мутности определенной

концентрации бактерий.

Для усиления процессов иммуногенеза в вакцины

в процессе изготовления стерильно добавляют адъю-

ванты. Это различные химические вещества органиче-

ской и неорганической природы: гидроокись алюми-

ния, алюмокалиевые квасцы, ланолин, сапонин. Они

создают на месте введения «депо» и усиливают гумо-

ральный и клеточный иммунный ответ на введенный

антиген.

Приготовленную вакцину проверяют на стериль-
ность, безвредность и активность (иммуногенность).

Все инактивированные препараты должны быть сте-
рильными. Для контроля на стерильность из препарата

делают высев на МПА, МПБ, МППБ и среды для выяв-

синсодержащей бульонной культуры добавляют 0,5%

ПРИНЦИП ПРИГОТОВЛЕНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ

375

 

ления микроскопических грибов. При высеве из живой

вакцины должна вырасти только одна культура, ука-

занная на этикетке. Важнейшим элементом контроля

на безвредность является проверка вакцины на лабора-

торных животных. Обычно используют от 3 до 5 живот-

ных на каждую серию изготовленной партии. Вакцина

безвредна, если у привитых животных она не вызывает

никаких патологических симптомов. Активность (им-

муногенность) определяют следующим методом: жи-

вотных иммунизируют испытуемой вакциной, через

две недели иммунизированным и контрольным живот-

ным вводят смертельную дозу культуры микробов, за

ними наблюдают в течение определенного времени. Им-

мунизированные животные должны остаться живыми

и здоровыми, а контрольные — погибнуть.

Химические вакцины представляют собой антигенные

комплексы, извлеченные из микробной клетки и очи-

щенные от балластных иммунизирующих веществ.

Анатоксины — экзотоксин, утративший свою ток-

сичность, но сохранивший антигенные и иммуногенные

свойства. Широко применяемыми анатоксинами явля-

ются вакцины против столбняка и ботулизма. При при-

готовлении столбнячного анатоксина к фильтрату ток-

 

формалина, инактивируют при 39С в течение 30 сут,

затем концентрируют удалением 80% надосадочной

жидкости и добавляют алюмокалиевые квасцы. Конт-

роль качества биопрепарата проводят по обычным пара-

метрам.

Все флаконы с биопрепаратами должны быть опеча-

таны и снабжены этикетками, на которых указывают

наименование препарата, биофабрику, дату выпуска,

срок годности, серию, номер госконтроля, дозировку.

Иммунные сыворотки и иммуноглобулины выпуска-

ются предприятиями биологической промышленности.

В качестве продуцентов иммунных сывороток использу-

ют лошадей, мулов, ослов, волов и реже другие виды жи-

вотных. Гипериммунизацию проводят нарастающими

дозами антигенов по утвержденным производственным

схемам, отличающимся продолжительностью иммуни-

376

ТЕМА 11

 

зации, интервалами между циклами иммунизации, до-

зами для каждого цикла введения антигена и реакцией

продуцента.

После окончания цикла иммунизации, когда в сы-

воротке крови животных-продуцентов находится мак-

симальное количество специфических антител, у жи-

вотных частично или тотально берут кровь. Кровь

помещают в термостат для свертывания, при этом от-

деляется прозрачная сыворотка, ее отсасывают и сте-

рилизуют, пропуская через бактериальные фильтры.

Сыворотку консервируют, добавляя 0,25–0,5% фенола,

разливают во флаконы с этикеткой.

Гипериммунные сыворотки применяют для лечебных

и профилактических целей, они создают у животных

лишь кратковременный пассивный иммунитет. Имму-

нитет после введения сыворотки наступает в ближайшие

часы, но не превышает 2–3 недель.

Безвредность каждой серии сывороточных препара-

тов проверяют на лабораторных животных, которым

подкожно вводят 10 мл сыворотки. Животные должны

оставаться здоровыми, без выраженных проявлений

местной и общей реакции.

Специфическую активность сывороточных препа-

ратов определяют с помощью реакции биологической

нейтрализации: чем меньше доза сыворотки, способная

нейтрализовать действие определенной дозы токсина,

тем выше ее активность.

Контроль бактериальной чистоты сывороточных пре-

паратов проводят по общепринятой методике высевами

из препарата на специальные питательные среды (МПА,

МПБ, МППБ и на агар Сабуро).

Диагностические антительные диагностикумы вы-

пускают предприятия биологической промышленно-

сти. Антительные диагностикумы применяют как из-

вестный компонент в серологических реакциях при

определении вида возбудителя, выделенного из иссле-

дуемого материала.

ПРИНЦИП ПРИГОТОВЛЕНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ

377

 

Диагностические антигенные диагностикумы гото-

вят на предприятиях биологической промышленности

по принципу приготовления инактивированных вак-

цин. Например, приготовление бруцеллезного антиген-

ного диагностикума проводят по следующей методике:

на обогащенном печеночном агаре выращивают бру-

целлезную биомассу из вакцинного штамма № 19, ина-

ктивируют нагреванием, устанавливают концентрацию

10 млрд микробных тел в 1 мл, консервируют фенолом,

разливают во флаконы с этикеткой. Применяют как из-

вестный компонент при исследовании сыворотки крови

на бруцеллез в РА, РСК.

Сальмонеллезный антигенный диагностикум пред-

ставляет собой 10-миллиардную взвесь сальмонелл. Его

применяют как компонент при постановке серологиче-

ской реакции при диагностике сальмонеллеза.

Стандартный сибиреязвенный антиген для РП

представляет собой прозрачный экстракт из убитых

нагреванием бацилл сибирской язвы, применяют для

контроля качества компонентов при постановке РП

при исследовании кожевенного сырья, мяса на сибир-

скую язву.

Аллергены выпускают предприятия биологической

промышленности. Представляют собой экстракты из

бактериальной массы, не должны обладать антигенны-
ми свойствами. Аллергены применяют для аллергиче-

ской диагностики туберкулеза (туберкулин), бруцеллеза

(бруцеллин), сибирской язвы (антраксин) и др.

Туберкулин готовят путем выращивания культур

микобактерий туберкулеза человеческого вида на мя-

сопептонном глицериновом бульоне в течение 6–8 не-

дель. Затем культуру автоклавируют, выпаривают до

1/10 объема, фильтруют через бактериальные фильтры

Зейтца и добавляют 50% глицерина от общего объема.

Контроль качества аллергена включает в себя уста-

новление стерильности и специфической активности.

Специфическую активность проверяют на здоровых и

реагирующих на аллерген животных параллельно со

стандартным аллергеном.

3.

378

ТЕМА 11

ЗАДАНИЯ