МЕТОДЫ СОЗДАНИЯ АНАЭРОБИОЗА

 

1. Физические методы основаны на том, что из за-

мкнутого пространства, в которое поместили посевы с

анаэробами, выкачивают воздух при помощи масляно-

го вакуумного насоса. Обычно в лабораторной практи-

ке применяют анаэростат или эксикатор с краном, че-

рез который при помощи вакуумного масляного насоса

удаляют воздух. При помощи этих насосов можно до-

стигнуть вакуума до 3–4 мм рт. ст. и даже до 0,05 мм.

Степень разрежения воздуха в анаэростате показывает

ртутный манометр, укрепленный на крышке прибора.

После выкачивания воздуха кран закрывают и прибор

ставят в термостат.

2. Химические методы создания анаэробиоза основа-

ны на том, что кислород, находящийся в эксикаторе или

анаэростате, связывают химическими препаратами. На-

пример, на дно эксикатора или анаэростата помещают

порошок пирогаллола и 10%-ный раствор едкого натра

(калия), при взаимодействии которых связывается весь

кислород из замкнутого пространства. Либо в эксикатор

ставят открытую чашку с увлажненной смесью гидросуль-

фита натрия с гидрокарбонатом натрия в соотношении

1:1, в результате взаимодействия между этими реагентами

происходит связывание кислорода воздуха.

3. Биологический метод создания анаэробиоза осно-

ван на совместном выращивании аэробов и анаэробов,

при этом рассчитывают на то, что вначале растет аэроб-

ная культура, а затем, после поглощения ею кислорода,

начинают развиваться анаэробы.

Например, в центре чашки Петри с сахарным, кровя-

ным агаром вырезают и удаляют полоску среды шириной

1–1,5 см, разделяя этим среду на две половинки. Затем

на одну половину чашки делают посев аэробов (Serratiae

marcescens, Bac. subtilis), а на другую половину делают

посев изучаемых анаэробов, края чашки герметизируют

лейкопластырем. Этот метод можно применять только

для нестрогих анаэробных бактерий.

4) исследуемый материал перед посевом следует про-

МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ АНАЭРОБНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

341

 

4. Комбинированный метод заключается в том, что

для большей надежности созданного анаэробиоза при-

меняют одновременно два метода. Например, вначале

выкачивают воздух при помощи насоса, а остаток кис-

лорода связывают химическим методом или наличием в

замкнутом пространстве посевов аэробных бактерий.

При культивировании анаэробов следует придержи-

ваться следующих правил:

1) для выращивания анаэробов применяют только

органические специальные питательные среды, в состав

которых входят глюкоза и кусочки печени или мышц,

играющие роль восстанавливающего фактора;

2) все жидкие питательные среды разливают высо-

ким столбиком, для изоляции от кислорода воздуха на

их поверхность наслаивают 2 мл вазелинового масла;

3) жидкие питательные среды перед посевом следу-

ет регенерировать в кипящей водяной бане в течение

20 мин для удаления воздуха;

 

гревать в водяной бане в течение 20 мин при 80С для

уничтожения сопутствующей вегетативной микрофлоры.

Особенностью посева анаэробных микроорганизмов

является то, что исследуемый материал в питательные

среды вносят в больших дозах, поэтому инструментом

для посева анаэробов служат не петли, а пастеровские

пипетки. Подготовленный исследуемый материал на-

бирают пастеровской пипеткой, верхний конец которой

плотно закрывают пальцем, а кончик пипетки вводят че-

рез масло в МППБ, являющийся накопительной средой.

Питательные среды, применяемые для культивиро-

вания анаэробов, делят на:

1) накопительные — для первичного посева;

2) дифференциальные — позволяющие дифференци-

ровать один вид от другого.

Накопительные среды. К накопительным средам от-

носится мясопептонный печеночный бульон (МППБ)

или среда Китта — Тароцци — основная питательная

среда для первичного выделения и последующего куль-

тивирования анаэробов. В ее состав входят печеночный

Глюкозо-кровяной агар — к расплавленному и ох-

глюкозы. Сахарный агар перед использованием расплав-

щими свойствами), наслаивают 2 мл вазелинового масла

342

ТЕМА 6

 

бульон и МПБ в соотношении 1:2, поваренная соль, рН

7,6. Среду разливают по пробиркам высоким столбиком,

добавляют кубики печени (обладающей восстанавливаю-

 

для изоляции от воздуха. Автоклавируют при 120С в те-

чение 30 мин. После длительного хранения МППБ перед

посевом пробирки с МППБ регенерируют 20 мин кипя-

чением в водяной бане и охлаждают перед посевом. В ре-

зультате размножения анаэробов на этой среде в первые

сутки появляется помутнение, у некоторых газообразо-

вание, а иногда и специфический запах.

Дифференциальные среды. На дифференциальных

средах анаэробы образуют колонии, характерные для

каждого вида, что позволяет дифференцировать их друг

от друга по культуральным признакам, а на некоторых

дифференциальных средах одновременно изучают и

ферментативные свойства. Методические приемы позво-

ляют выращивать строгие анаэробы без использования

анаэростата и эксикатора. К дифференциальным средам

относятся следующие питательные среды.

Сахарный агар — к обычному МПА добавляют 1%

 

ляют, охлаждают до 50С и добавляют нативный или

разведенный 1:10 исследуемый материал, тщательно

перемешивают, всасывают в стерильные узкие трубки —

трубки Вейона длиной до 20–25 см, диаметром около 1 см.

Один конец трубки запаивают, другой закрывают ватой

и помещают в термостат на сутки. На этой среде изучают

газообразование (разрыв агара) и форму изолированных

глубинных колоний, которые хорошо просматриваются

визуально или при помощи лупы в глубине агара. Для

некоторых анаэробов характерно образование колоний в

виде диска или двояковыпуклой линзы, колоний с тонки-

ми отростками, в виде комочка ваты и т. д.

 

лажденному до 50С обычному агару добавляют 1–2%

глюкозы, 15% дефибринированной крови барана, разме-

шивают и разливают по чашкам Петри. На поверхность

застывшего кровяного агара делают посев изучаемых

укладывают две спички без серной головки, на которые

МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ АНАЭРОБНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

343

 

анаэробов. На этой среде можно одновременно изучить

форму колоний на поверхности питательной среды и ге-

молитические свойства выделенного возбудителя. Чаш-

ки Петри с посевами анаэробов при культивировании

обязательно ставят в анаэростат.

Среда Вильсон — Блера, или железосульфитный

агар (ЖСА), — к 100 мл расплавленного МПА добавля-

ют 1–2% глюкозы, 10 мл 20%-ного раствора сульфита

натрия и 1 мл 8%-ного раствора хлорида железа. Уста-

навливают рН на уровне 7,8. В стерильную пробирку

вносят расплавленный ЖСА и исследуемый продукт

(материал), тщательно перемешивают и разливают в

чашки Петри по методу Перетца. Анаэробные бактерии

восстанавливают сульфит натрия до сульфата натрия,

который, вступая в реакцию с хлоридом железа, обра-

зует черный осадок сульфита железа, окрашивающего

колонии в черный цвет.

Метод посева анаэробов в модификации Перетца за-

ключается в том, что на дно чашки Петри параллельно

 

кладут стеклянную пластинку размером 5,55,5 см.

В подготовленную чашку наливают исследуемый ма-

териал, распределенный в ЖСА, который затекает в

образовавшийся зазор под стекло, где создаются стро-

гие анаэробные условия, после застывания среды по-

верх стекла наливают тонкий слой голодного агара для

полной изоляции от кислорода. Если в исследуемом ма-

териале были анаэробные бактерии, то во время куль-

тивирования в термостате они образуют колонии, окра-

шенные в черный цвет. В зависимости от количества

анаэробных бактерий в исследуемом материале почер-

нение среды может быть сплошным или в виде изоли-

рованных колоний. Большинство анаэробов образуют

колонии в течение 20–24 ч, для Cl. perfringens харак-

терно появление черных колоний уже через 6–8 ч после

посева.

Мозговая среда — готовится из свежего мозга крупно-

го рогатого скота, который пропускают через мясорубку,

заливают водой в соотношении: 2 части мозгового фарша

биком в пробирки, поверхность заливают 2 мл вазелино-

344

ТЕМА 6

 

и 1 часть воды, добавляют сульфит натрия с хлоридом

железа, как в ЖСА. Смесь раскладывают высоким стол-

 

вого масла, автоклавируют при 110С в течение 2 ч. Диф-

ференциальным признаком при росте анаэробов на этой

среде является ее почернение в результате образования

сероводорода, который вступает в реакцию с хлоридом

железа (образуется сернистое железо).

Молоко — к обезжиренному молоку добавляют ку-

сочки печени, сыворотку крови, разливают высоким

столбиком, наслаивают вазелиновое масло и дробно

стерилизуют. Дифференциальным признаком является

скорость свертывания молока, характер створаживания

и пептонизация его.

 

ЗАДАНИЯ