Облучение электромагнитными волнами

 

1. Ультрафиолетовые лучи (длиной 250–270 нм), по-

давляющие репликацию ДНК, широко применяются

для санации воздуха в животноводческих помещениях,

в цехах молочных заводов, в микробиологических бок-

сах для создания асептических условий. Для дезинфек-

ции воздуха применяют лампы низкого давления типа

БУВ-15, БУВ-60.

стекла дезинфицируют, погружая в 10%-ный раствор

2

2

ловой кислоты или щелочи.

328

ТЕМА 4

 

2. Ионизирующая радиация (холодная стерилиза-

ция) поражает генетический аппарат микробной клетки.

Гамма- и рентгеновское облучение применяют для унич-

тожения микроорганизмов на пластмассовых изделиях

одноразового применения, перевязочных материалах,

биопрепаратах (при этом не снижается их качество).

3. Действие ультразвука заключается в дезинтегра-

ции цитоплазматических структур микроорганизмов.

Применяют для стерилизации пищевых продуктов (мо-

лока, воды).

 

Химические методы

 

Химические вещества могут тормозить или полностью

подавлять рост микроорганизмов, поэтому их можно при-

менять с целью профилактики микробного загрязнения

питательных сред, вакцин, диагностических и лечебных

сывороток.

Вакцины и лечебные сыворотки консервируют карбо-

ловой кислотой (0,5%), формалином (0,5%), мертиоля-

том (1:5000).

Диагностические агглютинирующие сыворотки кон-

сервируют хлороформом (который при применении уле-

тучивается), борной кислотой, глицерином.

Мелкую стеклянную посуду, пипетки, предметные

 

Н O , 70-ный этиловый спирт, 5%-ный раствор карбо-

 

Для дезинфекции в лабораторной практике применя-

ют 3–5%-ные растворы карболовой кислоты, хлорамина.

 

 

Механические методы

 

Эти методы основаны на фильтрации жидкостей че-

рез специальные бактериальные фильтры, которые за-

держивают видимые под микроскопом микроорганиз-

мы. Через них свободно проходят вирусы и микоплазмы,

поэтому данные методы следует признать лишь как «ча-

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

329

 

стичную» стерилизацию.

Механические методы стерилизации рекомендует-

ся применять для биологических жидкостей, которые

нельзя прогревать, например сыворотку крови, раство-

ры витаминов.

Бактериальные фильтры имеют различную форму,

изготавливаются из различных материалов. Они отли-

чаются по величине пор, диаметр которых указан в при-

лагаемой инструкции.

В микробиологической практике широко используют-

ся фильтры-свечи, изготовленные из каолина с примесью

кварцевого песка (свечи Шамберлана), из инфузорной

земли (свечи Беркефельда) с различным диаметром пор, в

которых фильтрация происходит только под давлением.

Особенно широкое применение нашли так называе-

мые мембранные фильтры-диски различного диаметра,

толщиной 0,1 мм, изготовленные из асбеста, коллодия,

нитроцеллюлозы (они рассчитаны на одноразовое при-

менение). Фильтры монтируют в прибор Зейтца, ко-

торый состоит из приемного стакана-воронки и колбы

Бунзена. Перед работой собранный прибор завертывают

в бумагу и стерилизуют автоклавированием. Жидкость,

подлежащую стерилизации, наливают в воронку прибо-

ра, внутри колбы создают вакуум и жидкость проходит

через фильтры, освобождаясь от бактерий.

 

ЗАДАНИЯ

ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

 

1. Ознакомиться с компонентами питательных сред,

с рецептурой приготовления МПБ, МПА. Подготовить

и взвесить по рецепту сухой агар-агар, пептон, поварен-

ную соль, отмерить мясной экстракт мерными мензур-

ками, соединить все компоненты в колбе и поставить для

кипения на электроплитку.

2. Разлить приготовленный МПА в пробирки по 5 и

13 мл, закрыть пробками и подготовить для автоклави-

330

ТЕМА 4

 

рования. Одну пробирку для проверки качества агар-

агара скосить, охладить и убедиться в плотности среды.

3. Ознакомиться с фабричными питательными среда-

ми, приготовить из них агар Эндо, агар Левина по мето-

дике, указанной на этикетке.

4. Ознакомиться с оборудованием кафедры (горизон-

тальными и вертикальными автоклавами, электрическим

сушильным шкафом, аппаратом Коха), правилами рабо-

ты, техникой безопасности при работе с этими приборами.

5. Провести демонстрацию фильтрации воды через

фильтр из нитроцеллюлозы, применив аппарат Зейтца,

вмонтированный в колбу Бунзена.

6. Провести кипячение с целью стерилизации МПА

и МПБ в пробирках, пробирки поставить в термостат

на 24 ч, на следующем занятии проверить результаты

и убедиться, что спорообразующие остались и проросли

(в МПА и МПБ появились признаки роста).

7. Приготовить 3%-ный раствор карболовой кислоты

и 3%-ный раствор хлорамина.

 

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

 

1. С какой целью применяется стерилизация?

2. Что учитывают при выборе метода стерилизации?

3. На чем основаны физические методы стерилизации?

4. На чем основаны механические методы стерилизации и

для каких сред они рекомендуются?

5. Назовите недостатки таких методов стерилизации, как

кипячение и пастеризация.

6. Как готовят мясную воду?

7. Какие среды относятся к обычным и их назначение?

8. Какие среды относятся к дифференциально-диагности-

ческим и их назначение?

9. Какие компоненты придают селективность питательной

среде?

10. С какой целью добавляют ингибиторы в питательные

среды?

Тема 5

 

МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
АЭРОБНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

 

 

Цель занятия. Овладеть техникой посева бактерий на пи-

тательные среды. Ознакомиться с методами культивирова-

ния аэробных микроорганизмов. Освоить методы выделения

чистой культуры.

Материалы и оборудование. Пробирки со смесью золо-

тистого стафилококка и кишечной палочки. Чашки Петри с

МПА для выделения чистой культуры методом Дригальского,

чашки Петри с агаром Эндо для выделения чистой культуры

кишечной палочки, бактериологические петли, спиртовки.

Набор красок для окраски по Граму, предметные стекла, им-

мерсионное масло, микроскопы.

 

5.1. ТЕХНИКА ПОСЕВА БАКТЕРИЙ
        НА ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

 

Все микробиологические исследования проводят в

специальных помещених — боксах. Посевы и пересевы

проводят над пламенем спиртовки, инструментами для

посева служат бактериологические петли, иглы и пасте-

ровские пипетки.

332

ТЕМА 5

 

При посеве бактерий на питательные среды или пе-

ресеве из одной пробирки в другую применяют следую-

щую методику. Пробирку с чистой культурой и пробир-

ку со скошенным МПА берут в левую руку так, чтобы

пробирка с чистой культурой была первой по отноше-

нию к работающему. В правой руке находятся бактери-

ологическая петля и две пробки от открытых пробирок,

зажатые мизинцем и безымянным пальцем. Обжигают

края открытых пробирок и вводят прокаленную петлю

в пробирку с культурой. Петлю охлаждают о внутрен-

нюю стенку пробирки или прикасаются к участку не-

засеянного агара и, если он не плавится, захватывают

петлей часть бактериальной культуры. Быстро и осто-

рожно вносят петлю с культурой в пробирку со стериль-

ной средой, опускают до дна косяка и зигзагообразным

движением петли распределяют материал по скошен-

ной поверхности агара. После посева петлю извлекают,

обжигают края пробирок и закрывают пробирки обо-

жженными пробками, затем прокаливают петлю.

Для посева в жидкие питательные среды применяют

методику, описанную выше, только петлю с бактериаль-

ной культурой вносят в МПБ.

Посев на плотные среды в чашках Петри проводят

также бактериологической петлей или стеклянным

шпателем. Для этого крышку чашки Петри чуть припод-

нимают левой рукой, вводят под крышку бактериологи-

ческую петлю с посевным материалом и распределяют

посевной материал по поверхности среды различными

методами в зависимости от конечной цели: штрихом для

получения изолированных колоний или сплошной посев

«газоном».

В пробирки с посевами, закрытых ватными пробка-

ми, и в чашках Петри, прикрытых крышками, воздух

проникает во внутрь, что позволяет аэробным бактериям

хорошо развиваться.

МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ АЭРОБНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

333

5.2. МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
        БАКТЕРИЙ

 

 

Для выращивания микроорганизмов в лабораторных

условиях применяют термостат, в котором круглосуточ-

но автоматически поддерживается постоянная темпера-

тура.

Термостат представляет собой двустенный шкаф с

сетчатыми полками внутри и открывающейся дверью,

сделанными из теплоизолирующих материалов. Между

двумя стенками находится дистиллированная вода или

воздух, если термостат суховоздушный. Источником на-

гревания в термостате являются электронагревательные

элементы, которые прогревают воду или воздух. Тем-

пература автоматически поддерживается на заданном

уровне, для большинства сапрофитных и патогенных

микроорганизмов в пределах 37С, так как эта темпера-

тура для них является оптимальной. При выращивании

МАФАнМ (мезофильных аэробных и факультативно-

анаэробных микроорганизмов), для которых оптималь-

ной является температура 30С, применяют другой

суховоздушный термостат. Таким образом, в микробио-

логической лаборатории должны быть два термостата: с

температурой 37 и 30С. В термостат помещают штати-

вы с пробирками, колбы и чашки Петри с посевами из-

учаемых микроорганизмов.

Для успешного культивирования бактерий необхо-

димо применять свежие питательные среды. Особенно

это касается плотных питательных сред, которые раз-

ливают в чашки Петри или скашивают в пробирках

обязательно в день посева, чтобы были видны капель-

ки свежего конденсата. При выращивании аэробов и

факультативных анаэробов аэрация происходит в ес-
тественных условиях без применения каких-либо до-

полнительных приборов.

334

ТЕМА 5

 

Сроки культивирования большинства патогенных,

условно патогенных микроорганизмов составляют 24–

48 ч, только некоторые растут медленно, например воз-

будитель туберкулеза 10–14 дней.

Для полного понимания темы необходимо знать спе-

циальные термины, применяемые в микробиологиче-

ской практике.

Посев — первичное внесение исследуемого матери-

ала в питательные среды. Цель посева — выделение и

накопление возбудителя для дальнейшего изучения.

Пересев — перенос выросшей бактериальной культуры

в новую питательную среду. Бактериальной культурой

называют микроорганизмы, выросшие на искусствен-

ных питательных средах. Различают чистую бактери-

альную культуру, в которой все бактерии относятся к

одному виду, и загрязненную, если в ней присутствуют

неизвестные бактерии. Любое бактериологическое ис-

следование начинают с выделения чистой культуры, так

как только в чистой культуре можно определить вид воз-

будителя.

Перед началом работы пробирки с 5 мл МПА расплав-

ляют в кипящей водяной бане, пробирку с горячим жид-

ким агаром фиксируют в наклонном положении, чтобы

получить скошенную поверхность, удобную для посева.

Для этого конец пробирки с пробкой приподнимают и

кладут на пластинку высотой 1–1,5 см, в результате на

дне пробирки должен получиться столбик высотой 3 см,

переходящий в косяк. Пробирку с 15 мл МПА также

расплавляют и выливают в стерильную чашку Петри,

крышку чашки закрывают, чашку ставят на ровную по-

верхность, после охлаждения получается плотная пла-

стинка среды, готовая для посева.

При посеве необходимо соблюдать следующие пра-

вила: работа должна проводиться в боксе, над пламенем

спиртовки, петлей нельзя прикасаться к посторонним

предметам, ватные пробки на стол не класть. Начинаю-

щим бактериологам нужно предварительно приобрести

навыки работы в боксе: имитируя посевы над пламенем

МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ АЭРОБНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

335

 

спиртовки, открывая и закрывая пробирки, научиться

одновременно держать в правой руке бактериологиче-

скую петлю и три пробки, имитируя посевы с пустыми

пробирками и чашками.

 

5.3. МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТЫХ
        КУЛЬТУР БАКТЕРИЙ

 

Обычно исследуемый материал, содержащий возбу-

дителя пищевых токсикоинфекций, возбудителя ин-

фекционной болезни, загрязнен сопутствующей микро-

флорой — выделить чистую культуру из исследуемого

материала является основной задачей при проведении

бактериологического исследования.

Морфологические, культуральные и ферментатив-

ные особенности микроорганизмов, необходимые для

определения вида микроорганизма, изучают, применяя

только чистые культуры бактерий.

В лабораторной практике применяются следующие

методы выделения чистой культуры.

 

 

Механические методы

 

Они основаны на механическом разъединении бак-

терий друг от друга. В истории микробиологии извест-

ны метод Пастера, Коха, но в лабораторной практике

чаще применяют метод Дригальского. Суть этого ме-

тода заключается в том, что бактериологической пет-

лей каплю исследуемого материала (кровь, молоко,

мясо) наносят на поверхность плотной среды в чашке

Петри и распределяют по поверхности так, чтобы ме-

ханически разъединить бактерии, каждая из которых

должна образовать изолированную колонию. Бакте-

рии, оставшиеся на поверхности питательной среды,

размножаются поперечным делением со скоростью

336

ТЕМА 5

 

20–30 мин, поэтому за сутки образуют видимую ко-

лонию. При этом надо учитывать, что одна бактерия
образует одну колонию, поэтому все бактерии в этой

колонии будут принадлежать к одному виду. После по-

сева чашку маркируют, ставят в термостат при 37С на

24 ч. Появившиеся колонии изучают с помощью лупы,

нужную колонию обводят восковым карандашом со

стороны дна чашки, готовят из нее мазок и окрашива-

ют по Граму. При микроскопии изучают морфологиче-

ские особенности (форма, наличие споры и капсулы) и

отношение бактерий к окраске по Граму. Далее, чтобы

получить чистую культуру, из нужной колонии бакте-

риологической петлей делают пересев на МПА и МПБ

в пробирках. На следующий день из выросшей культу-

ры делают препарат для микроскопии и, убедившись

в том, что выделенная бактериальная культура мор-

фологически однородная, приступают к изучению ее

культуральных, ферментативных свойств и подвиж-

ности для определения вида.

 

 

Биологические методы

 

Они основаны на учете биологических особенностей

бактерий, таких как устойчивость к высокой темпе-

ратуре и кислоте, подвижность, а также их патоген-

ность.

1. Применение высокой температуры. Для выделе-

ния чистой культуры спорообразующих микроорганиз-

мов исследуемый материал прогревают 10–20 мин при

80С в расчете на то, что менее стойкие вегетативные

формы погибнут при этой температуре, а споры останут-

ся жизнеспособными. Из прогретого материала дела-

ют первичный посев в питательные среды, на которых

вырастают изолированные колонии спорообразующих

микроорганизмов. Из этих колоний делают пересев в

4.

МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ АЭРОБНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

337

 

пробирки с МПА и МПБ и получают чистую культуру

нужного возбудителя.

2. Для выделения чистой культуры кислотоустой-

чивых возбудителей туберкулеза патологический ма-

териал обрабатывают 5–10%-ным раствором серной

кислоты в течение 10–15 мин. Благодаря действию

кислоты погибает сопутствующая микрофлора, а воз-

будитель туберкулеза остается жизнеспособным. После

нейтрализации раствора кислоты 1%-ным раствором

гидроксида натрия исследуемый материал вносят на

специальные питательные среды, на которых растут

возбудители туберкулеза.

3. Для выделения чистой культуры патогенных ми-

кроорганизмов, находящихся в загрязненном исследу-

емом материале, проводят заражение молодых воспри-

имчивых лабораторных животных (кролики, морские

свинки, белые мыши). Организм животного здесь играет

роль биологического фильтра, через который проходят

патогенные микроорганизмы, вызывающие гибель жи-

вотного. После заражения и гибели животных трупы

вскрывают и из всех внутренних органов делают пре-

параты на предметном стекле, а также посевы на пита-

тельные среды. Полученную чистую культуры изучают,

определяют вид возбудителя.

Выделение подвижных микроорганизмов (метод

Щукевича). С поверхности исследуемого материала

(мясо, колбаса) бактериологической петлей делается

соскоб, который вносят в конденсат скошенного МПА,

пробирку ставят в термостат при 37С на 24 ч. Если в ис-

следуемом материале были подвижные палочки протея,

они дают характерный ползучий рост вверх по скошен-

ному агару, из появившихся колоний делают посев на

питательные среды, получают чистую культуру и опре-

деляют ее вид. Наличие палочки протея в исследуемом

материале свидетельствует об антисанитарных условиях

хранения продуктов питания.

338

ТЕМА 5

ЗАДАНИЯ