ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

 

 

1. Освоить методы изучения ферментативных свойств

кишечной палочки и сальмонелл на демонстрационных

посевах на среды Гисса (короткий пестрый ряд) и агаре

Эндо. Определить вид «зашифрованного микроба», посе-

янного в пробирки короткого пестрого ряда по измене-

нию цвета индикатора и наличию газа в поплавках, ис-

пользуя данные биохимической дифференциации.

2. На агаре Эндо провести дифференциацию колоний

кишечной и сальмонеллезной палочек по цвету колоний.

Очень демонстративно получается, если слова E. coli и

Salmonella написать на поверхности агара.

ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ (БИОХИМИЧЕСКИЕ) СВОЙСТВА БАКТЕРИЙ

355

 

3. Освоить методы изучения протеолитических свойств

бактерий на МПЖ, на молоке.

4. Освоить методы определения сероводорода, ам-

миака, индола, выделяемых изучаемыми микроорга-

низмами.

 

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

 

1. С какой целью изучают ферментативные свойства бакте-

рий?

2. Какие углеводы входят в среды Гисса и до каких конеч-

ных продуктов происходит расщепление углеводов?

3. Какие ферментативные свойства изучают у бактерий?

4. С какой целью изучают ферментативные свойства бак-

терий?

1) гифомицеты:

Тема 9

 

МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ ГРИБЫ —
ПЛЕСНЕВЫЕ ГРИБЫ И ДРОЖЖИ

 

Цель занятия. Изучить морфологические и культуральные

свойства микроскопических грибов различных таксономиче-

ских групп.

Материалы и оборудование. Чашки Петри с посевами ми-

кроскопических грибов: Penicillium,

Aspergillus, Mucor, а

также пробирка со взвесью пекарских дрожжей в физиологи-

ческом растворе. Микроскопы, микологические крючки, пре-

паровальные иглы, предметные и покровные стекла, флакон-

чик со смесью воды, спирта и глицерина в равных объемах для

приготовления препарата из плесневых грибов.

 

Микроскопические грибы — хемоорганотрофные ми-

кроорганизмы, эукариоты, не содержащие хлорофил-

ла. Относятся к царству Fungi (лат.) или Mycota (греч.),

включающему в себя около 120 тыс. видов. Широко

распространены в природе: почве, воде, растениях, про-

дуктах питания. Дифференциация плесневых грибов и

дрожжей иногда затруднена, так как есть переходные

формы, различия между которыми почти неуловимы.

В качестве критерия, отличающего дрожжи от плесе-

ней, используют способность плесеней образовывать

длинные, разветвленные нити-гифы:

 

 высшие, микомицеты, многоклеточные;
 низшие, фикомицеты, одноклеточные;

 у

 у

МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ ГРИБЫ — ПЛЕСНЕВЫЕ ГРИБЫ И ДРОЖЖИ

357

 

2) дрожжи (плесневые грибы), одноклеточные (мице-

лий отсутствует), иногда образуют псевдомицелий.

Вегетативное тело гриба состоит из ветвящихся ните-

видных гифов, переплетение которых образует мицелий

или грибницу. Различают субстратный мицелий, нахо-

дящийся в глубине питательной среды, и воздушный,

возвышающийся над средой, часто несущий специаль-

ные органы размножения.

У низших грибов мицелий несептирован и представ-

лен одной разветвленной клеткой с ядрами и без перего-

родок.

У высших грибов в гифах имеются перегородки (сеп-

ты), разделяющие их на отдельные одноядерные или

многоядерные клетки.

Микроскопические грибы размножаются вегетатив-

ным и репродуктивным способами.

Вегетативное размножение происходит без специаль-

ных органов размножения — одноклеточными или мно-

гоклеточными обломками мицелия, образующимися

при распаде мицелия. При старении культуры каждая

клетка покрывается оболочкой, превращается в особую

форму существования (хламидоспоры, оидии, артро-

споры, бластоспоры), которая, попав в благоприятные

условия, также может дать жизнь новому организму.

Все перечисленные виды спор представляют собой видо-

измененный мицелий, т. е. их образование относится к

вегетативному способу размножения.

Репродуктивный способ размножения при помощи
спор. При этом различают бесполое и половое размно-

жение.

Бесполое размножение осуществляется посредством

разнообразных органов спороношения:

низших грибов — на верхушке вертикальных

спорангиеносцев формируется шарообразный

спорангий, заполненный эндоспорами;

высших грибов — на специализированных

ответвлениях гифов — формируются конидие-

носцы, заканчивающиеся булавовидными утол-

щениями со стеригмами, метулами, из которых

выталкиваются экзоспоры или конидии.

поверхность черной пушистой массой, видимой невоору-

358

ТЕМА 9

 

При половом размножении грибов спорообразова-

нию предшествует половой процесс. Грибы, у которых

обнаружен половой способ размножения, относятся к

совершенным грибам, без полового процесса — к несо-

вершенным. Способы полового размножения неодинако-
вы. В результате полового процесса у Ascomycota образу-

ются аски — специализированные сумки, заполненные
аскоспорами, а у Basidiomycota — на поверхности бази-

дий — экзогенные базидиоспоры.

 

 

9.1. МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ
        ОСОБЕННОСТИ НЕКОТОРЫХ

        НИЗШИХ И ВЫСШИХ ГРИБОВ

 

Типичный представитель фикомицетов (низших гри-
бов) — Mucor, или головчатая плесень. Мицелий мукора

состоит из одной разветвленной клетки, от которой вер-

тикально отходят воздушные гифы — спорангиеносцы,

заканчивающиеся черными круглыми спорангиями (го-

ловками), поэтому мукор иногда называют «головчатая

плесень». После созревания и разрыва спорангия много-

численные эндоспоры заражают все вокруг, попадая на

поверхность пищевых продуктов, кормов и окружающие

объекты. При благоприятной влажности эндоспоры обиль-

но размножаются на продуктах питания, покрывая всю

 

женным глазом. Активный рост прекращается при 5–8С.

К самым известным представителям микомицетов
(высших грибов) относятся грибы родов Penicillium,

Aspergillus.

Penicillium — плесень кистевик, имеет ветвящийся,

септированный мицелий. При микроскопии препаратов

из мицелия видны конидиеносцы, имеющие на верхуш-

ке мутовки, из которых выходят цепочки конидий (эк-

зоспор). Пенициллы хорошо развиваются при достаточ-

ной аэрации и влажности на всех пищевых продуктах.

Пустоты внутри и поверхность продуктов покрывается

зеленоватой бархатистой плесенью, вызывающей порчу

продукта, придающий привкус плесени.

МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ ГРИБЫ — ПЛЕСНЕВЫЕ ГРИБЫ И ДРОЖЖИ

359

 

Aspergillus — леечная плесень, имеет септированный

мицелий. При микроскопии видны конидиеносцы, за-

канчивающиеся булавовидным расширением, окружен-

ным стеригмами, из которых выходят цепочки конидий.

Аспергиллы хорошо развиваются на мясных и молоч-

ных продуктах, на поверхности которых появляются

колонии зеленой плесени.

К высшим несовершенным грибам отнесены микро-

скопические грибы, у которых половой способ размно-

жения не установлен.

Ниже приведены представители микроскопических

грибов, являющихся виновниками порчи пищевых про-

дуктов и кормов.

Cladosporium — при микроскопии виден септиро-

ванный мицелий и конидиеносцы, на питательном суб-

страте образуют коричневые или черные бархатистые

колонии. На воздушных гифах мицелия формируются

овальные, расположенные в цепочку споры. Хорошо

растут при низких температурах и обладают высокой

протеолитической активностью. Находясь на поверхно-

сти мяса, мясных продуктах, эта плесень проникает в

толщу мышечной ткани.

Плесень этого рода вызывает так называемое вну-

треннее плесневение масла (образование черных пятен)

при наличии внутренних пустот. Может вызвать порчу

сыра и яичных продуктов.

Oidium lactis — на питательной среде образуют белый

септированный мицелий. Оидии в виде овальных кле-

ток отделяются непосредственно от кончиков мицелия.

Молочная плесень имеет вид белого пушистого налета,

появляется на поверхности молочных продуктов — сме-

тане, твороге, кефире, в результате чего происходит

снижение кислотности, приводящее к активизации гни-

лостных бактерий и порче продукта. При длительном

хранении при низкой температуре могут развиваться

схожие с Oidium lactis другие плесневые грибы, такие

как Candida и Oospora.

Alternaria — от основных нитей мицелия гриба отходят

короткие конидиеносцы, заканчивающиеся грушевид-

ными или заостренными многоклеточными конидиями,

ность питательной среды в чашке Петри, выращивают

использованием, добавляя к расплавленной и охлажден-

размножаются при помощи спор. В асках образуется от 4

360

ТЕМА 9

 

окрашенными в оливковый, бурый цвет. Плесени этого

вида могут развиваться на охлажденном и замороженном

мясе, масле и других продуктах.

Дрожжи — одноклеточные организмы, округлой

или удлиненной формы, с двухконтурной оболочкой и

дифференцированным ядром. Размножение дрожжей

происходит почкованием, половым путем, а некоторые

 

до 12 спор. Оптимальной является температура 20–30С,
но многие из них способны развиваться и при 10С.

Дрожжи широко распространены в природе: почве,

растениях, в воздухе, откуда они попадают на пищевые

продукты. Они являются виновниками порчи пищевых

продуктов, в зависимости от вида дрожжей в продуктах

происходит сбраживание углеводов, появляется прогор-

клый вкус у масла. Некоторые виды дрожжей способны

развиваться даже в средах с 24% NaCl.

 

9.2. ОСОБЕННОСТИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
        ПЛЕСНЕВЫХ ГРИБОВ

 

Для выращивания микроскопических грибов приме-

няют специальные питательные среды — Сабуро, Чапе-

ка, сусло-агар.

При первичном выделении грибов из исследуемого

материала в питательные среды для подавления сопут-

ствующей микрофлоры добавляют пенициллин из рас-

чета содержания антибиотика 50 или 100 ЕД в 1 мл сре-

ды, а стрептомицина — 0,1 г на 1 мл среды. Питательные

среды с антибиотиками готовят непосредственно перед

 

ной до 50С питательной среде растворы антибиотиков.

Подозрительный по качеству исследуемый материал

(сыр, масло, колбаса, мука, зерно) вносят на поверх-

 

при 28С в течение 5–10 дней. Для каждого вида гриба

характерны свои культуральные особенности. Являясь

МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ ГРИБЫ — ПЛЕСНЕВЫЕ ГРИБЫ И ДРОЖЖИ

361

 

строгими аэробами, они образуют на поверхности пита-

тельной среды бархатистые, войлочные или кожистые

колонии различной пигментации. По мере появления

колоний изучают морфологические и культуральные

свойства для дифференциации плесневых грибов.

 

 

9.3. ОСОБЕННОСТИ ИЗУЧЕНИЯ
        МОРФОЛОГИИ ПЛЕСНЕВЫХ ГРИБОВ

 

Методика. На предметное стекло наносят каплю сме-

си, состоящей из равных объемов воды, спирта и гли-

церина. При помощи бактериологической петли и пре-

паровальной иглы в эту каплю вносят часть мицелия

изучаемых плесневых грибов, осторожно прикрывают

покровным стеклом, находят объект под 8-кратным

объективом и изучают под увеличением в 400 раз. Ми-

кроскопические грибы не окрашивают — их изучают в

нативном виде, поэтому при микроскопии для увеличе-

ния контрастности надо опустить конденсор, прикрыть

ирисовую диафрагму. При микроскопии обращают вни-

мание на наличие перегородок в мицелии, отмечают осо-

бенности строения органов спороношения, так как толь-

ко по органам спороношения можно определить родовую

и даже видовую принадлежность.

Агар Чапека рекомендуется применять для выращи-

вания многих видов грибов. Среду готовят следующим

образом: на 1000 мл воды добавляют 30 г глюкозы, 2 г

нитрата натрия, 1 г дигидрофосфата калия, 0,5 г суль-

фата магния, 0,5 г хлорида калия, 0,0012 г сульфата же-

леза и 20 г агара.

Агар Сабуро применяют при выращивании возбуди-
телей дерматомикозов и кандидамикозов. Среду гото-

вят следующим образом: на 1000 мл воды добавляют 40 г

глюкозы, 10 г пептона и 18 г агара. После стерилизации

рН питательной среды должен быть 6,5.

Для изучения морфологии дрожжей на лаборатор-

ном занятии используют взвесь пекарских дрожжей в

физрастворе, которые равномерно распределяют тонким

3.

362

ТЕМА 9

 

слоем на предметном стекле, фиксируют физическим

методом и окрашивают метиленовой синью в течение

3–5 мин. Дрожжевые клетки располагаются одиночно,

имеют овальную форму, в молодой культуре часто обна-

руживают почкующиеся дрожжи. Обратите внимание,

препарат можно изучать уже при 400-кратном увеличе-

нии, а при изучении культуры дрожжей под иммерсией

всегда можно обнаружить сопутствующую бактериаль-

ную микрофлору.

 

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ
РАБОТЫ

 

1. Изучить культуральные свойства микроскопиче-

ских грибов, выросших на питательной среде в чашках

Петри. Обратить внимание на особенности мицелия —

войлочный, бархатистый; пигмент — зеленый, черный,

оливково-бурый.

2. Приготовить препарат из мицелия плесневых грибов

Penicillium, Aspergillus, Mucor, провести микроскопию,

найти органы спороношения, микрокартину зарисовать.

3. Приготовить препарат из взвеси пекарских дрож-

жей, окрасить простым методом, изучить микрокарти-

ну, найти почкующиеся дрожжевые клетки, микрокар-

тину зарисовать.

 

 

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

 

1. Характеристика низших и высших микроскопических

грибов.

2. Краткая характеристика способов размножения плесне-

вых грибов.

Краткая характеристика морфологических признаков

дрожжей.

4. С какой целью добавляют антибиотики в питательные

среды при культивировании плесневых грибов?

Тема 10

 

СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ

БОЛЕЗНЕЙ

 

Цель занятия. Дать представление о сущности серологи-

ческих реакций, реакции преципитации, реакции агглюти-

нации, антигенах и антителах, о применении серологических

реакций в микробиологической практике

Материалы и оборудование. Уленгутовские пробирки в

штативах. Диагностикумы — преципитирующая сибиреязвен-

ная сыворотка в фабричном флаконе с этикеткой, нормальная

сыворотка во флаконе с этикеткой, стандартный сибиреяз-

венный антиген в ампуле с этикеткой; физраствор в пробир-

ках, пастеровские пипетки, можно градуированные пипетки

с тонким капилляром, листок с черным фоном. Компоненты

для постановки реакции: пробирки с антигеном № 1 (сибире-

язвенный антиген биофабричного приготовления — положи-

тельный), пробирки с антигеном № 2 (экстракт из кожевенного

сырья — отрицательный).

Для постановки РА на предметном стекле: суточная ага-

ровая сальмонеллезная культура, коробка с поливалентной и

набором монорецепторных О- и Н-агглютинирующих сальмо-

неллезных сывороток, физиологический раствор в пробирке,

бактериологическая петля, предметные стекла, глазные пи-

петки, спиртовка.

Таблицы. Реакция диск-преципитации. Реакция диффузион-

ной преципитации в агаровом геле.

364

ТЕМА 10

 

Свое название серологические реакции получили от

латинского слова serum, что означает сыворотка крови,

являющаяся обязательным компонентом всех сероло-

гических реакций. Во всех серологических реакциях

происходит физико-химическое взаимодействие между

двумя компонентами: антигеном и антителом. Суть се-

рологических реакций заключается в том, что один из

компонентов всегда неизвестен, так как он находится

в исследуемом материале, а второй компонент — всегда

известен, так как он биофабричного изготовления, с эти-

кеткой — он получил название «диагностикум». Таким

образом, природу неизвестного компонента определяют

при помощи известного диагностикума. Специфическая

реакция между антигеном и антителами происходит в

присутствии электролитов, т. е. как в организме живот-

ного (in vivo). Роль электролита в условиях пробирки (in

vitro) выполняет 0,85%-ный раствор поваренной соли

(известный как физиологический раствор). Все компо-

ненты серологических реакций разводят физиологиче-

ским раствором до рабочего титра, указанного на этикет-

ке и в инструкции.

Антигены — это высокомолекулярные, генетически

чужеродные вещества белковой природы, которые при

введении в организм животного вызывают образование

антител (иммуноглобулинов (Ig)). В микробиологии к

антигенам относятся живые или убитые микроорганиз-

мы, а также продукты их жизнедеятельности — токси-

ны, продукты метаболизма.

В санитарной микробиологии роль антигенов выпол-

няют микроорганизмы, выделенные из исследуемых пи-

щевых продуктов, вид которых можно определить, при-

меняя микроскопические, бактериологические методы

исследования (семь признаков которых мы изучили) и

серологические реакции. Например, постановкой серо-

логической реакции агглютинации (РА) на предметном

стекле с известными поливалентными и монорецептор-

ными агглютинирующими сыворотками.

Антитела — специфические белки (иммуноглобу-

лины (Ig)), образующиеся в организме клетками иммун-

СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ

365

 

ной системы под воздействием антигена и обладающие

свойством специфически с ним связываться. В результа-

те специфического воздействия антител на антиген и в

организме, и в пробирке происходят визуально видимые

изменения антигена — он агглютинируется (склеивает-

ся), лизируется (растворяется), преципитирует (осаж-

дается), нейтрализуется, т. е., другими словами, он по-

вреждается и разрушается. В зависимости от характера

антигена и условий взаимодействия с ним антител, т. е.

по изменениям, происходящим с антигеном, в лабора-

торной практике применяют следующие реакции: реак-

ция преципитации (РП), реакция агглютинации (РА),

реакция связывания комплемента (РСК), реакция ней-

трализации и др. При этом действие антител строго спе-

цифично, они взаимодействуют только с теми антигена-

ми, которые вызвали их появление.

Серологические реакции используются:

1) для определения вида неизвестных бактерий при

помощи известных антител, находящихся в диагности-

ческой сыворотке (антительный диагностикум с этикет-

кой);

2) для обнаружения в исследуемой сыворотке крови

больного неизвестных антител при помощи диагности-

кума, содержащего известные бактерии-антигены (ан-

тигенный диагностикум с этикеткой).

 

10.1. МЕТОДИКА ПОСТАНОВКИ
           РЕАКЦИИ ПРЕЦИПИТАЦИИ

 

Суть реакции состоит в осаждении или преципи-

тации высокодисперсного антигена под воздействием

специфических антител, находящихся в иммунной

сыворотке. В результате положительной реакции ан-

тиген переходит в грубодисперсное состояние и обра-

зует видимый невооруженным глазом «комплекс ан-

тиген + антитело» в виде серо-белого кольца, который

называется преципитат.

карболизированного физиологического раствора и экс-

366

ТЕМА 10

 

Антиген в данной реакции называется преципитино-

геном, а антитела — преципитинами.

В ветеринарной практике реакция преципитации

применяется для исследования мяса, кожевенного и ме-

хового сырья, загнившего патологического материала с

целью диагностики сибирской язвы.

Реакция преципитации применяется также в судеб-

ной медицине и ветеринарии для определения видовой

принадлежности крови и в ветеринарно-санитарной экс-

пертизе для выявления фальсификации мясных, рыбных

продуктов и др. При помощи этой реакции можно опреде-

лить, из мяса какого вида животных (свиного, говяжьего

и др.) приготовлен тот или иной мясной продукт.

Реакция преципитации была разработана Асколи

(1910) в основном для исследования кожевенного сырья

на сибирскую язву, т. е. для выявления неизвестных ми-

кробных антигенов при помощи известных антител. Для

ее проведения необходимы следующие компоненты.

1. Экстракт из исследуемого сырья — это компонент

РП, содержащий неизвестный антиген, находящийся в

растворимом, высокодисперсном состоянии. Этот ком-

понент можно приготовить двумя методами.

Холодный способ. Измельчают 1 г кожи (кожи, мяса),

растирают в ступке со стерильным речным песком, пере-

носят каждую пробу отдельно в пробирку, заливают 9 мл

 

трагируют 16–18 ч в условиях холодильника при 4–6С.

Горячий способ. 1–2 г материала измельчают, поме-

щают в пробирку, заливают 9 мл физиологического рас-

твора и экстрагируют в кипящей водяной бане 30 мин

(этот метод применяют в экстренных случаях).

Затем полученные экстракты фильтруют через асбе-

стовую вату — экстракт должен быть прозрачным, так

как он является высокодисперсным, некорпускуляр-
ным. Экстракт даже со следами незначительного помут-

нения надо перефильтровать. В экстракте, полученном

из материала больных животных (кожи, мяса), содер-

жится сибиреязвенный антиген в высокодисперсном со-

стоянии, наличие которого надо доказать.

СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ

367

 

2. Преципитирующая сибиреязвенная сыворотка во

флаконе с фабричной этикеткой содержит известные

антитела. Эту сыворотку получают на предприятиях

биологической промышленности путем гипериммуниза-

ции лошадей-продуцентов, которым многократно (10–

13 раз) вводят возбудитель сибирской язвы (антиген)

с интервалом в 3–7 дней в возрастающих дозах от 5 до

70 мл. Через 14 дней после последнего введения антиге-

на у лошадей берут кровь в количестве 5–6 л, отделяют

от нее прозрачную сыворотку, содержащую антитела

и получившую название «гипериммунная преципити-

рующая сыворотка». Гипериммунную специфическую

сыворотку консервируют добавлением 0,5% фенола, от-

стаивают в течение 2 мес., стерилизуют фильтрованием

и разливают в стерильные флаконы (50 мл) с этикеткой.

Это известный компонент реакции преципитации со-

держит противосибиреязвенные антитела, при помощи

которых определяют наличие и природу неизвестного

антигена.

3. 0,85%-ный раствор поваренной соли (физраствор)

рН 7,2–7,4.

4. Для контроля — специфический сибиреязвенный

антиген, прозрачный экстракт возбудителя сибирской

язвы (биофабричный), в ампулах с этикеткой.

5. Для контроля — нормальная сыворотка без анти-

тел, полученная от здоровых животных, в ампулах с эти-

кеткой.