Полимеразная цепная реакция. Принцип, условия проведения.

Метод позволяющий размножить определенный фрагмент днк, ограниченный с обоих концов.

Эти ограничения обеспечиваются затравками(праймерами), которые служат для затравки полимеразы.

Нужны:

1)Полимераза-термостабильная

2)Праймеры-комплимент. Концам получ. Фрагментов

3 этапа:

1)Денатурация нити ДНК

94 градуса 1-5 мин(1 цикл)

Образ.смесь одноцепочечн.молекул

1 этап. Денатурация ДНК. Кратковременное нагревание нативной ДНК приводит к изменению ее физико-химических свойств, в частности, вязкости, происходит разрушение водородных связей, соединяющих комплементарные цепи, и разъединение цепей исходной молекулы ДНК. В та-

ком состоянии каждая цепочка может служить матрицей для репликации.

Протекает при 93–95 0С в течение 30–40 с.

2)3 цикла(отжиг праймеров и синтез фрагментов)

94 градуса 30 с(25-35 циклов)-поддерж расплет нити

Х градусов 30 с, где Х-температура отжига праймеров(завис от сост нукл-в)

72 градуса(для Taq-полимеразы) 1 мин на 1000 п.н. – собственно синтез фрагмента

2 этап. Присоединение праймеров (отжиг) при охлаждении реакционной смеси. Присоединение праймеров происходит комплементарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического участка. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой располагаются в интервале 50–65 0С. Время отжига 20–60 с.

 

3)72 градуса 5-10 мин(1 цикл)-этап досинтеза(работа полимеразы)

3 этап. Синтез ДНК (элонгация). С участием термостабильной ДНК-полимеразы (Taq-полимераза) происходит избирательный синтез (копирование) участка ДНК, расположенного между двумя праймерами. Амплификация происходит в том случае, если расстояние между праймерами нахо-

дится в пределах 50–4000 оснований. Синтез ДНК идет от 5’ к 3’-ему концу в обоих направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. То есть наращивание праймеров происходит навстречу друг другу. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служит добавляемая в буферный раствор смесь

четырех дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (дНТФ). Процесс происходит при температуре 70–72 0С. Время протекания синтеза – 20–40 с.

 

 

Возможности полимеразной цепной реакции (синтез одноцепочечной ДНК, заякоренная ПЦР, Alu-ПЦР, синтез регуляторных участков).

Синтез одноцепочечной днк:

Суть:1 из праймеров берется в 100кратном недост(по сравнению с другим). На ранних циклах происх образов 2хцепочечн фрагм. Но к 20 циклу кол-во праймера, взятого в недостатке, исчерпывается=>образ.одноцепочечный фрагм(их накопл носит линейн хар-р), этого достаточно для копир ДНК-зондов, фрагм для секвенирования и т.д.

Заякоренная ПЦР

Часто в мол ДНК известен только 1 конец(а для пцр надо знать 2).

Чаще всего известна 3’-послед мРНК=>получ кДНК, к 3-концу достраив, напр, полиГ(с помощью полимеразы)=>эта последоват гибридиз с праймером, имеющий полиЦ. Т.е. можно нарастить конец днк и сделать к нему заякоренный праймер.

Алю-ПЦР

Если информация о нукл послед полностью отсутствует.

Подходит для анализа генома млекоп-х.

В геноме млекопит есть 0,5 млн копий Alu-ретротранспозонов. Это небольш последоват ДНК(330 п.н.), разбросанных по геному. Выдел неск сем-в Alu, они очень гетерогенны. Эти последов разрез рестриктазой Alu1. Последовательности Alu известны=>можно амплифициров фрагм ДНК м/у двумя Alu(к ним можно сделать праймеры).

Синтез регуляторн уч-в(инвертированная пцр)

Известен ген, известен регул уч-к

1.ДНК разрез с пом рестриктаз, кот не затрагив последоват генов(искл рестриктазы, сайты кот встреч со средн частотой). Напр, EcoR1

2.Мол лигируются. Лигаза обеспечив образов кольцев мол, в кот часть известна, а часть, окаймляющ ген-неизвестна.

3.Исп «вывернутые» праймеры к гену(ориентир наружу)=>амплифицир уч-к, окаймляющ известн последовательн

4.Затем этот уч-к встраив в вектор и секвенир

 

Принцип получения мутаций с использованием полимеразной цепной реакции.

Одна из возможностей ПЦР- внесение в копируем. ДНК мутаций.

Праймер входит в сост. ДНК=> на 5-конце м.б. распол.

-сайты рестрикции

-промоторы

-метки

-мутации

Праймер д.б. строго комплементарен матрице только на 3-конце, одиночн. изменения не препятствуют прохождению ПЦР.(особенно около 5-конца)

Мутация м.б. или в R-праймере или в F-праймере, или в том и том-зависит от цепи.

С помощью ПЦР вносят измен. в любое место(точечн. мут, делеции, вставки)

Для этого используют перекрывающийся ПЦР

Суть: прод.ПЦР получ в ходе 3х независ р-ций

-1 и 2:получ перекрывающиеся продукты

-3:добавл прод из 1 и 2 р-ций обеспеч амплифик измен-й мол ДНК

 

Точечные мутации

1)Синтезир 2 пары праймеров

F и R(внешние праймеры, отжиг. на концах уч-ка)

F’ и R’(внутренние праймеры, перекрыв. с уч-ком, где ходим получить измен.), содерж измен. нукл.

рис-1 и 2 р-ции – независимо др от др получ фрагм с внесенными изм

рис-3 р-ция – в кач-ве матрицы исп получен фрагм-ы

3 р-ция: в ходе денарур(94С) прод превращ в одноцепочечн(т е могут связыв др с др)

(достаточно 15-20 нукл)

Если в 3-ю р-цию полимеразу, то она может достраив 3-концы мол. до 2хцепочечн.

В 3-ю р-цию доб прайм F и R+полимераза =>2хцепочечн ДНК с изменен нукл-ом(ами). F и R-праймеры обеспечив ее копирование.

Делеция

Вставки