Генетическая организация ретровирусов (гамма-ретровирусов и лентивирусов).

Содержат однонитевую РНК(плюс-цепь) длиной 6-9 тысяч нуклеотидов, на концах которой расположены прямые терминальные повторы LTR и примыкающие к ним уникальные последовательности: U5 на 5’-конце и U3 на 3’-конце. Между ними находятся три локуса – gag, pol и env, кодирующие полибелки Gag, Gag-Pol и Env. В капсиде находятся две молекулы тРНК. Молекулы тРНК служат праймерами в реакции обратной транскрипции для синтеза первой «-» нити ДНК, связываясь для этого с вирусной РНК в сайте P, расположенном в области U5-gag. Для праймирования синтез «+» нити ДНК важен полипуриновый тракт Pu, находящийся в области env-U3. Сложная цепь полимеразных реакций завершается формированием линейной двунитевой ДНК, которая путем консервативной транспозиции с помощью интегразы внедряется в клеточную хромосому, образуя провирус.

Гамма-ретровирусы :

Как и у простого ретровируса, геном включает гены структурных белков gag, pol и env. И прямые повторы LTR и примыкающие к ним уникальные последовательности: U5 на 5’-конце и U3 на 3’-конце.

Вирусный комплекс этих векторов, ответственный за интеграцию вирусной кДНК в геном клетки, имеет слишком большие размеры, чтобы проникать через поры в оболочке клеточного ядра. Поэтому вирус может инфицировать только делящиеся клетки (это связано с тем, что они способны проникать в ядро только во время митотического разрушения ядерной оболочки). Кроме того, гамма-ретровирусы случайным образом интегрируются в геном хозяина, что может привести к онкогенезу

Лентивирус:

Наиболее изученным лентивирусом является ВИЧ. Он рассматривается как потенциальный вектор для переноса генов в условиях in vivo. Подобно простым ретровирусам, геном включает концевые повторы LTR, гены структурных белков gag, pol и env, и гены шести регуляторных белков, названных tat, rev, vpr, vpu, nef и vif. Продукты этих генов принимают участие в регуляции репликации геномной РНК. Длинные концевые повторы имеют длину около 600 нуклеотидов, участок U3 имеет длину 450, последовательность R — 100 и участок U5 около 70 нуклеотидов. Гены отдельных белков могут быть убраны из генома вируса без снижения его способности к размножению и инфицированию клеток. Концепция построения современных лентивирусных векторных систем доставки генов в организм млекопитающих. Лентивирусы способны заражать соседние клетки при непосредственном контакте без образования внеклеточных частиц. Лентивирусы способны поражать и активно делящиеся клетки и неделящиеся клетки, тк. обладают механизмом активного переноса в ядро.

Векторные системы животных на основе ретровирусов (гамма-ретровирусов и лентивирусов). Принципы конструирования («пакующие» клетки, псевдотипирование, тканеспецифичные промоторы). Примеры использования.

А) Векторные системы животных на основе ретровирусов. Принцип конструирования.

Ретровирусы обладают однонитевой РНК, но их жизненный цикл обязательно проходит через стадию образования двунитевой ДНК, что позволяет использовать их для генно-инженерных операций. Как векторы они обладают определенными преимуществами:

· У них исключительно широкий круг клеток-хозяев.

· Структура интегрированной ДНК ретровирусов исключает возможность перестройки клонированного в ней гена.

· При ретровирусной инфекции клетки не погибают и в течении многих генераций продуцируют вирусы, что дает возможность в случае клонирования в ретровирусах чужеродных генов создавать продуценты, постоянно синтезирующие заданный продукт.

Вмешательство в геном ретровируса приводит к его дефектности. Однако, если в нем сохранить концевые повторы LTR и сайты P, Pu, psi, S, действующие in cis, то недостающие функции рекомбинантного вируса могут быть компенсированы продуктами, поставляемыми in trans вирусом-помощником или специальными линиями клеток. Конструирование рекомбинантных ретровирусных геномов ведут в клетках E.coli с помощью плазмидных векторов, в которых клонирован провирус. В таких челночных векторах селективный и целевой гены обычно находятся под вирусным промотором, расположенным в левом LTR, но можно клонировать их с другими промоторами. Селективный ген удобно интегрировать вместо локуса env. В этом случае его трансляция будет происходить с мРНК, образующейся в результате сплайсинга по S-сайтам геномной РНК.

Рекомбинантной плазмидой трансформируют подходящую линию животных клеток, одновременно инфицируя их вирусом-помощником. В плазмиде будет транскрибироваться только ее вирусная часть с клонированными генами, так что инфицированные клетки будут производить смесь дефектных и недефектных вирусов. Интроны, содержащиеся в клонированных генах, удаляются в процессе созревания рекомбинантных вирусов, и в дальнейшем гены существуют в безынтронном виде. Функции, недостающие дефектному рекомбинантному вирусу, могут поставляться также резидентным провирусом. Удобны для этой цели провирусы, у которых нарушен процесс сборки вириона.

Б) Пакующие клетки лентивируса:

Сборка (упаковка) лентивирусного вектора происходит в так называемых упаковывающих клетках. Они представляют собой перевиваемые клетки, в которых осуществляется синтез вирусспецифических белков. Пакующая система таких клеток включает как минимум три типа экспрессирующих кассет (пакующая, векторная и оболочечная), ни одна из которых без участия других кассет не может «собрать» вирусную частицу, способную проникать в клетку-мишень. В то же время их одновременная экспрессия не приводит к образованию ретровирусных частиц, вызывающих инфекционный процесс у человека.

Пакующая система работает следующим образом. Введенная в пакующие клетки в составе плазмиды пакующая кассета под контролем промотора цитоме-галовируса (CMV-промотора) экспрессирует гены ВИЧ, необходимые для формирования инфицирующей вирусной частицы. Но из кассеты исключен ген env, кодирующий белки-предшественники оболочки ВИЧ (Env), определяющие его способность выходить за пределы клетки. Первые лентивирусные векторные системы содержали в пакующих кассетах гены регуляторных белков ВИЧ (Vpu, Vpr, Vif, Nef, Rev, Tat). При дальнейшем усовершенствовании векторной системы из пакующих кассет были удалены гены регуляторных белков ВИЧ, LTR, а также последовательности, кодирующие пакующий сигнал (у) и праймерсвязывающий сайт (PBS). Это позволяло избежать случайную упаковку полной мРНК ВИЧ в вирусную частицу. Векторы второй генерации включали только гены Tat- и Rev-белков. Третья (современная) генерация пакующих систем включает обычно две плазмиды: одна кодирует Gag- и Gag-pol-белки (Gag формируют сердцевину ВИЧ, Pol - его ферментную систему соответственно); вторая - Rev-белок (избирательно активирует синтез структурных белков вируса и обеспечивает экспорт из ядра длинных молекул вирусной РНК).

В) Тканеспецифичные промоторы

Для того чтобы транскрипция трансгена в клетке-мишени была эффективной, генотерапевтами разработаны методы транскрипционального таргетинга, предполагающие введение в такие векторы специфических для данных тканей промоторных последовательностей. Примеры таких промоторов, используемых в тканеспецифических лентивирусных векторах. Создание оболочки, которая позволяет проникать в клетки необычной специфичности. Пример, промоторы в глазу и в сердце.

Г) Псевдотипирование

Б) Примеры использования.

1. Провирус вируса лейкоза мышей Молони содержится в мышиных клетках линии NIH 3T3. Трансформация этих клеток позволяет получать чистый препарат рекомбинантных вирусов. Инфицирование ими нормальных клеток приводит к образованию рекомбинантного провируса, его интеграции в хромосому и экспрессии целевого гена.

2. Химерный гликопротеин RD114, полученный благодаря слиянию трансмембранного и внеклеточного доменов гликопротеина эндогенного ретровируса кошачьих с цитоплазматическим доменом гликопротеина амфотропного вируса MLV 4070A, позволяет псевдотипированному вектору эффективно трансдуцировать мезенхимальные стволовые клетки с очень низкой цитотоксичностью.