Механизм копирования ColE- репликона. Векторные системы на основе ColE1-репликона (pBR322, pUC18/19).

15.1. Механизм копирования ColE- репликона.

Репликация начинается с сайта OriV, который имеет два промотора.

1) С P2 в направлении к оri-сайту РНК-полимераза синтезирует транскрипт РНК II(2)

²⁾ PHK II образует гибрид с ДНК в области ori. Образуется гетеродуплекс ДНК + РНК II

³⁾ РНКаза Н гидролизует 3’конец РНК II, освобождая 3’-OH группу.

⁴⁾ ОН группа выступает в роли праймера для иницициации репликации ДНК-полимеразой I по лидирующей нити.

Синтез ДНК начинается со сборки праймосомы на сайте pas(150 нуклеотидов от oriV). Далее, на другом сайте pas на лидирующей линии (400 нуклеоттидов от oriV) происходит смена ДНК-полимеразы 1 на ДНК-полимеразу 3.

15.2. Вектор pBR322

4361 п.н.

- Содержит репликатор плазмиды рМВ1.

- Мультикопийный (15—20 копий )

- Способность к амплификации в присутствии хлорамфеникола.

- От плазмиды pSC101 через плазмиду pMB9 передан признак устойчивости к тетрациклину

- От Rldrd19, содержащей Tn3, через плазмиду RSF2124 передан признак устойчивости к ампицилину

Наличие двух генов устойчивости к антибиткам, содержание уникальных сайтов рестрикции(Ap^R – 4, Tc^R – 10) позволяет встраивать в них чужеродные гены и отбирать гибридные молекулы.

Механизм

1) Один из генов разрезается

2) Встраивается чужеродная ДНК

3) Лигирование

4) Внесение гибридной молекулы в клетку E.Coli

5) Отбор трансформантов по устойчивости к одному из антибиотиков, вставку регистрируют методом отпечатков.

1) Метод прямой селекции:

Можно отбирать рекомбинантов этим методом при встраивании чужеродной ДНК в ген устойчивости к ампицилину. Основан метод на том что бета-лактамаза, кодируемая этим геном, превращает пенициллин в пеницилловую кислоту(способна связывать йод). Трансофрманты высевают на среду, содержащую тетрациклин и крахмал, затем выросшие колонии опрыскивают раствором, содержащим пенициллин и йод, при этом Ap^R -колонии обеспечивают индикаторный раствор, а Ap^s – нет.

2) Ген устойчивости к тетрациклину содержит сайт для рестриктазы HindIII. Внедрение чужеродной ДНК в этот сайт инактивирует промотор и убирает устойчивость к антибиотику. Но если встраивать чужеродный промотор, то устойчивость к антибиотику сохраняется.

На основании pBR322 конструируютсяпроизводные векторов различного назначения.

Включение в pBR322 маркера устойчивости к хлорамфениколу, взятого из транспозона 9 фага P1Cm получают pBR326 – повышается возможность встраивания чужеродного ДНК(так как повышается количество сайтов рестрикции + в Cm^R  есть сайт EcoR1)

15.3 pUC18/19

2686 п.н.

20 сайтов рестрикции в полилинкере

Предназначены для клонирования и экспрессии генов

Нет регуляторных последовательностей –> до 500 копий на клетку

*Как правило, все современные вектора парные, то есть отличаются только последовательностью полилинкера: pUC18 – HindIII -> EcoRI

pUC19 – EcoRI -> HindIII

Парность определяется организацией полилинкера, все остальные - одинаково.

От pBR322 - ori-сайт + Ap^R

Селективным признаком, позволяющим отличить рекомбинанты выступает Lac-фенотип. Это обеспечивается экспрессионной кассетой.(из однонитевыхт векторов M13mp)

Строение экспресс. кассеты:

1) Промотор+оператор лак-оперона + БАК-сайт

2) Начальная чатсь гена ЛакЗет, кодирующая укороченный альфа-пептид бета-галактозидазы из 145 АМК.

На 4 я думаю верхней инфы хватит, дальше идет конченный механизм или че это хз, если есть время - можно прочитать. Это полная копия конспекта Титок.

В хромосоме E.Coli – лак оперон с делецией лакЗет(и дальше без пробела хуйня какая-то типа треугольникM15)(кодирующий дефектную бета-галактозидазу, у которой отсутствует АК с 11 по 41 – фенотип Lac минус)

pUC в Lac минус клетке - > альфа-комплиментация - > Lac плюс фенотип.