Рестриктазы класса III

Ферменты рестрикции. Классификация, значение для генной инженерии. Рестриктазы класса II. Классификация. Условия реакции рестрикции.

 

Ферменты рестрикции – 3935

Тип I - 94

Тип II - 3817

Тип III -14

Тип IV – 10

Потребность в ионах Мg2+ характерна для всех рестриктаз, а для работы ферментов типа I, III и IV, кроме того, обязательно присутствие в среде АТР и S-аденозилметионина.

238 ферментов узнают уникальные нуклеотидные последовательности (прототипы). Остальные же эндонуклеазы, открытые позднее, узнают участки ДНК, идентичные уже известным прототипам и входят в группу, так называемых, изошизомеров.

Название рестриктазы сответствует названию рода и вида микроорганизма (обозначается тремя латинскими буквами )

 Escherichia coli - Eco

 Bacillus stearothermophilus - Bst

Рестриктазы 1

Расщепляют ДНК в произвольных местах на расстоянии от нескольких сот до нескольких тысяч пар нуклеотидов от сайтов узнавания, образуя при этом сплошной спектр фрагментов. Поэтому эти рестриктазы в генетической инженерии практически не используют, так как с их помощью нельзя получить фрагменты ДНК строго определенного размера. Системы рестрикции-модификации этого типа присутствуют в бактериях E . coli K 12 и их необходимо учитывать при клонировании чужеродной ДНК в клетках данных микроорганизмов. Рестрикцию ДНК обеспечивает комплекс R₂М₂S (рестриктазы, метилазы и белка S), обеспечивающим связь всего комплекса с сайтом узнавания). Субъединицы комплекса кодируются генами hsdR, hsdM и hsdS. С целью предотвращения деградации чужДНК ее вводят, как правило, только в клетки, мутантные по гену hsdR.

Рестриктазы 2

Сайты расщепления совпадают с сайтами узнавания или находятся рядом с ними на строго определенном расстоянии, что позволяет получать фрагменты рестрикции определенной длины. Кроме того, рестриктазы и метилазы этого класса действуют независимо, что весьма удобно в экспериментальном плане. Поэтому они широко применяются для генетического конструирования in vitro, выделения генов, их физического картирования с целью определения последовательности нуклеотидов в ДНК и т. д. Первым описанным ферментом этого класса была рестриктаза HindIII и EcoRI (1970).

Самые важные характеристики этих рестриктаз — структура их сайтов узнавания и способ расщепления ДНК.

Подкласс II Р (самый многочисленный)

1. Сайт узнавания состоит из четного числа нуклеотидов: тетра-, гекса- и октануклеотидных последовательностей (4, 6, 8)

2. Сайт узнавания содержит обращенные палиндромы (последовательности с вращательной симметрией второго порядка). Рестриктазы этого подкласса действуют либо на определенные сайты, например,

либо на сайты, в которых присутствуют альтернативные основания, занимающие симметричные позиции. Например, по четыре сайта узнавания имеют рестриктазы HaeIи Нае II :

Подкласс IIW

1. Сайт узнавания состоит из нечетного числа нуклеотидов: пента- и гептануклеотидные палиндромы (5 и 7)

2. Центральный нуклеотид может быть

а. альтернативным (Pu — пурин или Ру — пиримидин)

б. любым (N)

3. Фланкирующие нуклеотиды, стоящие в симметричных положениях, также могут быть альтернативными

Подкласс IIN

Узнают палиндромы, прерываемые несколькими произвольными нуклеотидами.

SfiI

 

Подкласс IIS

Расщепляют ДНК на определенном расстоянии от сайта узнавания (от 1 до 20 п.н.).

Подкласс IIT

Расщепляют в самом сайте.

По способу расщепления ДНК рестриктазы класса II распадаются на два типа.

1. Осуществляют ступенчатый разрез нитей ДНК (положения гидролизуемых связей на разных нитях не совпадают). В местах разрезов (↓↑) выступающие последовательности нуклеотидов, относящиеся к разным нитям ДНК, являются комплементарными (липкими).

А. Выступать могут 5'- концы

2. Осуществляют прямой разрез нитей ДНК (расщепляются совпадающие связи). В результате у фрагментов ДНК образуются, соответственно, выступающие однонитевые или ровные (тупые) концы.

Если сайты расщепления совпадают с сайтами узнавания. такие сайты называют еще сайтами рестрикции. Когда они представлены палиндромами, то на разных нитях ДНК гидролизуются связи, расположенные либо симметрично относительно центра палиндрома, либо в самом центре.

Знак "↓" указывает на положение гидролизуемых связей, которое

 

Для рестриктаз, узнающих непалиндромные последовательности нуклеотидов и расщепляющих ДНК в стороне от сайтов узнавания, в кратких записях указывают в скобках для каждой нити расстояния от них до гидролизуемых связей. Например, рестриктазу HgaIхарактеризует запись GACGC(5/10). Она расшифровывается следующим образом

Многие рестриктазы, даже выделенные из очень разных бактерий ( относящихся к разным семействам), узнают на ДНК одинаковые сайты. Такие рестриктазы называют изомерами. Они подразделяются на изошизомеры и гетерошизомеры (неошизомеры). Первые не только узнают одинаковые сайты, но и одинаково их расщепляют, а вторые эти сайты расщепляют по-другому.

Гетерошизомерами являются, например, рестриктазы

Asp 7181 (5'-G↓GТАСС-3') и KpnI (5'-GGTAC↓С-3').

Некоторые рестриктазы характеризуются большим числом изомеров.

Рестриктазы класса III

сходны с рестриктазами класса I в том, что они действуют в одном комплексе с метилазами и узнают несимметричные последовательности нуклеотидов. Комплекс состоит из двух субъединиц. Способность к специфическому связыванию с ДНК присуща только метилазе, поэтому ее называют MS-субъединицей. Расщепление ДНК R-субъединицами происходит на определенном расстоянии от сайтов узнавания. Например, рестриктаза

R М-система класса IV

представлена 10 ферментами. Например, фермент Есо571, в одной полипептидной цепочке которого имеются обе активности — эндонуклеазная и метилазная. Фермент характеризуется сайтом