Векторные системы на основе вируса SV40 (вирусные и плазмидные вектора).

ПЛАЗМИДНЫЕ ВЕКТОРА

ВИРУСНЫЕ ВЕКТОРА

Организация экспрессионных кассет в векторных системах для животных. Способы достижения высокого уровня экспрессии чужеродных генов в животных клетках.

Базовыми элементами эукариотической экспрессионной кассеты является промотр и сайт полиаденилирования,в котором формируется 3'-конец транскрипта.В отличие от сигналов процессинга мРНК,которые функционируют эфеективно во всех типах клеток животных,детальное строение промоторов и энхансеров значительно варьирует у разных генов.Многие энхансеры активны только в определенных тканях или действуют только в пристствии определенных факторов.Эти обстоятельства следует учитывать при выборе или конструировании векторов.Наиболее уникальны вирусы энхансеры вирусов SV40 и саркомы Рауса.Сигналы сплайсинга хотя и универсальны ,но не безразличны к прилегающим к ним экзонным последовательностям.В случае конструирования рекДНК,в транскрипте которой будут соеденены не взаимодействующие в норме сигналы сплайсинга,сплайсирование может быть неточным.Апробирование различных эукариотических экспрессионных кассет было проведено путём их конструирования в составе плазмиды pBR322 и последующим наблюдением временной экспрессии после трансформации клеток.Для достижения высокого уровня экспрессии чужеродных генов в животных клетках следует учитывать некоторые правила.

-вторичная структура в 5'-нетранслируемой области мРНК препятствует эффективной странсляции

-кодон АУГ в 5'-нетранслируемой области мРНК мешает правильному инициирующему кодону

-Консенсусом около инициирующего кодона у высших эукариот является последовательность CC(A/G)CCAUGG

Отмечено,кроме того,что присутствие AU-богатой области в 3'-нетранслируемой области мРНК уменьшает ее стабильность.

Селективные маркеры в векторных системах животных

Маркер – гены кодирующие устойчивость к АБ либо токстческим веществам , клонированные в плазмиды.

1. Гены, продукты которых осуществляют метаболтзм азотистых оснований :

- аденинфосфорибозил трансфераза

-гипоксантингуанинфосфорибозил трансфераза

- тимидинкиназы

-ксантингуанинфосфорибозил трансфераза

( реципиенты – только мутантные клетки)

2. Гены, обеспечивающие селекцию в случае их мультипликации (дигидрофосфатредуктаза)- позволяют работать с немутантами

3. Гены-репортеры (cat, lux, lac Z)

4. Гены бактериального происхождения (gpt, neo)- позволяют работать с немутантами