Фосфорамидитный метод.

Фосфоромидит-нукл-д, кот модифицирован у кот:

1)защищены азот основ(к аминогр дизоксиА(Ц) доб бензол гр; к дизоксиГ-изобутиридную гр)

Защита от модиф при росте цепи

2)к 5-он гр первого нукл доб ДМТ

3)фосфит гр замещена метильным остатком

3-он перв нукл присоед к спейсеру(послед-ть ковалентно связана с носителем(стекл шариком))

Этапы:

1.С помощью ТХУ отщипл 5’-ДТМ от присоед нуклеотида для того, чтобы высвоб реакционно способный 5-он гр=>активирование

2.В колонку одновременно ввод нуклеотид(защищ со всех сторон в виде фосфорамидита) и тетразол(активация и присоед).Тетразол активир фосфорамидит так, что 3-фосфотн гр обр ковал св с 5-он гр перв нукл-да.

3.Непрореаг 5-он гр ацетилир с пом уксус ангидрида и диметиламинопиридина(кэпирование)

4.фосфодиэф св,образ на 2м этапе м.у. нукл-ми, нестабильна и может разорв в присут к-ты или щелочи. Поэтому фосфиттриэфир окисл с пом йодн смеси до более стабильн 5-валент фосфаттриэфира.

Затем цикл повторяется заново. после каждого этапа колонки промывают. реакцию проводят до тех пор пока к растущей цепи не присоединяется все нукл. Синтезир-ый олигонукл связыв со стеклянным шаром; каждый фосфаттриэфир несёт метил гр; каждый Г Ц и А сод защищенную аминогруппу, а на 5-конце последнего нуклеотидов находится ДМТ группа.

Метил гр удаляют с помощью химической обработки прямо в реакционной колонке=> олигонукл отсоединяют от спейсера вместе с 3-он концом и элюируют из колонки=> последн удаляются бензольные, изобутирильные и ДМТ группы. 5-конец ферментативно фосфорилир.

 Чтобы выход продукт был высоким, эффективность присоед нуклеотидов на каждом этапе должен быть не ниже 98 % (если синтезированная последовательность из 20 нуклеотидов, то только 82 % оснований будет иметь нужную длину=> разделение в ПААГ=> выделение цепочки нужного размера.

Синтез одноцепочечные молекулы используется для:

-ПЦР

-Секвенирование

-изучение зондов

-получением линкеров и адаптеров

если химический синт двухцепочечн ДНК предполагает исп в качестве гена или его фр, то каждую из её цепей синтезируют отдельно. Полученные гены 60 80 пар нуклеотидов: синтезируют комплиментарные цепи а затем

идёт отжиг.

Дидезоксинуклеотидный метод определение нуклеотидной последовательности ДНК. Принцип секвенирования Illumina. Сферы применения.

Дидезоксинуклеотидн метод.

-ферментативный метод(с радиоактивной меткой)

-полим-зация цепи с обрывом

Компоненты р-ции:

-праймер(1 шт)

-dNTP(ATP, GTP,CTP, TTP)

-радиоакт мечен dNTP(1:100); метка Р32

-днк

-днк-полим

+ddNTP-в кажд из 4х пробирок-1 тип; нет он-гр и 3-конца=>остановка синтеза после присоед ddNTP к растущ цепи.

В смеси используют ДНК-полимеразу, олигонуклеотидные праймеры и смесь четырех дезоксинуклеотидов (dNTP) (А, Т, G и C), один из которых радиоактивно помечен по α-положению фосфата (³²P). В каждую из четырех реакций добавляется по одному 2’,3’-дидезоксинуклеозидтрифосфату (ddATP, ddTTP, ddCTP или ddGTP, т.е. один из них во все пробирки), которые терминируют дальнейшую реакцию (синтез комплементарной молекулы ДНК с матрицы) — таким образом в каждой пробирке образуется набор фрагментов ДНК разной длины, которые заканчиваются одним и тем же нуклеотидом. Затем полученные фрагменты днк разделяют в полиакриламидном геле (с точностью до одного нуклеотида), проводят электрофорез и по картине распределения фрагментов в четырех пробах устанавливают нуклеотидную последовательность ДНК .

Процесс секвенирования Illumina

Копии ДНК разрезаются в случайных местах на большое число небольших участков. ) К каждому участку с двух сторон добавляют специальные адаптеры – заранее известные небольшие последовательности нуклеотидов.

Подготовка ДНК

1. Исследуемая двуцепочечная ДНК фрагментируется.

2. К двуцепочечным фрагментам с помощью ДНК-лигазы пришивается небольшой ДНК-фрагмент — адаптер. Адаптер состоит из двух олигонуклеотидов, частично комплементарных друг другу. При смешении таких олигонуклеотидов образуется «вилка», «ножка» которой состоит из двуцепочечной ДНК (там где олигонуклеотиды комплементарны), две «ручки» состоят из одноцепочечной ДНК. Лигаза пришивает два адаптера за «ножку» к каждому концу исследуемого фрагмента ДНК.

3. Далее роисходит амплификация полученных фрагментов ДНК с помощью ПЦР. В результате образуется множество фрагментов двуцепочечной ДНК, на одном конце — первый олигонуклеотид, составляющий адаптер, на другом конце — второй (один из них содержит сайт для рестриктазы.