Способы введения векторов в клетки бактерий.

Вводятся путем трансформации. Трансформация - это поглощение клеткой экзогенной ДНК, то есть введение в клетку чистой ДНК, или клеткой способной поглощать ДНК из вне. Чаще всего компетентность клетки (готовность) вызывают исскуственно. Наиболее распростаненный метод обработки клеток двух валентными катионами кальций хлор2, или магний so4 и т. д. Подбираются эти соли на холоду, либо электропорацией а именно пробой клеточной стенки электрическим током. Иногда последовательные циклы замораживания и оттаивания также может ослаблять клеточн. стенку и делать ее проницаемой (при этом клетки должны оставаться живыми). Нужно сказать что трансформировать можно в исходные клетки, а можно в протопласты и сферопласты, дпбавляя к ним ДНК. Значит можно ввести электропорацией или трансформацией - это все будет трансформация. То есть это обработка клеток либо каль.. либо магн.. ионами на хлоду либо электрическим током.

Обрабатывать можно протопласты и сферопласты электрическим током для того чтобы можно было ввести чужеродную ДНК.

Кальциевый метод наиболее распространенный и простой, основан он менделем и хиго в 1970. Был обнаружен факт что клетки е коли выдержанные на холоду в присуствии хлористого кальция становятся компетентными для трансформации. Затем было показано что точно так можно вводиь и плазмиды это уже в 1972г. Эффективность трансформации может достигать 10 в седьмой трансформантов на 1 микро грамм ДНК pBR322. Считается что 100 микро литров компетентных клеток оптимально воспринимают 50 нанограмм днк.

Клетки выращивали до лог фазы роста, затем концентрируют до плотности 10 в десятой клеток в 1миллилитре в холодном 50 мили молярном кальций хлор2. Концентрируют просто сгущают и помещают в холодный 50 мили молярный кальций хлор2, выдерживают на льду 30 мин, затем к клеткам которые стали компетентными добавляют плазмидную ДНК (сколько писал выше) и выдерживают еще 30 мин на льду, затем подвергают тепловому шоку 42 град –в теч. 2мин,, затем высевают на чашки с селективной средой.. Но перед высевом клетки качают при аэрации выращивают 30-60 мин не в селективной среде – для фенотипической экспрессии.

Протокол можно записать след. образом:

1) ночная культура

2) лог фаза (для этого ночн. культуру разводим 1 к 50)

3) лог фазу сгущают до 10 в десятой клеток, которые переносят затем в кальций хлор 2 на 30 мин ,, темпер 4 градуса.

4) вносим ДНК (сколько выше) , оставляем на 30 мин , 4 град

5)шок 42град- 2 мин

6) Экспрессия 37 град (для е коли) 30-60 мин

7)высев

Эффективность трансформации зависит от бактериального штамма и структуры трансформируемой ДНК. Двунитивые, однонитивые кольцевые ДНК, и линейные с кольцевыми шпильками котор. Замыкают обе цепи хорошо трансформируются в клетки к то время как линейные ДНК с открытыми концами хуже на 2-3 порядка, это вызвано тем что они разрушаются экзонуклеазой 5 которая кодируется генами rec BCD . Поэтому для ввода линейных берут реципиенты мутантные по этим генам. Лучше всего вводятся кольцевые до 10 килобаз молекулы.

Электропорация.

Соли которые входят в те компоненты в которых хранится ДНК могут негативно сказываться на электропорации, поэтому лучше всего электропорировать ДНК растворенную в воде. Даже при наличии солей происходит пробой в кюветах, поэтому лучше всего использовать ДНК растворенное в воде. После этого кювету шириной 0,2 см подвергается электрическим импульсом напряженность 12,5 кило вольт на 1 см и продолжительностью 5 мили сек. Ток подбирают для разных типов клеток экспериментальным образом, от 6 до 25 кило В на 1 см. Для е коли стандарт 12,5.

Далее немедленно клетки переносим в полноценную питательную среду жидкую, выращивают при аэрации в течение часа и высевают на селективную среду.

Чем удобна трансформация тем что компетентные клетки можно замораживать и хранить их при минус 70 град , поэтому если необходимо произвести трансформацию размораживаем клетки добавляем ДНК и далее как написано выше. Для электропорации клетки готовятся свежими, не хранят.

С помошью элект.. можно вводить мелкие и крупные ДНК, этот метод универсален для всех клеток.

Организация Т-ДНК и vir-локуса. Ti-плазмид A. tumefaciens.

тДНК – 6 генов, обеспеч синтез фитогормонов (ауксин и цитокинин) – онкогены и опинов (октопин, нопалин) – проиводные аргинина, входят опероны, обеспеч утилизацию опинов

Vir -локус – 27 генов в 5 оперонов

virB оперон – 11 генов, которые кодируют белки, обеспечивающие формирование поры, через которые тДНК выходит из бактерий и попадает в растения

virD оперон – 5 генов, ключевые virD1, virD2 – белки необходимы для вырезания тДНК из плазмиды, а virD4 является интегральным (пронизывает мембрану) – моторный белок, обеспечивает перенос через пору

vir C – 2 гена, влияют на спектр хозяев

virE – 2 белка, необходимы для переноса тДНК в растения, ключевой virE2 связывается с тДНК и предохраняет от действий нуклеаз

Экспрессия этих оперонов индуцируется, когда бактерии находятся в контакте с растениями и в ответ на фенольные соединения, которые выделяет растение