Общая характеристика плазмид бактерий (фенотипические маркеры, размеры, классификация). Понятие «базового репликона».

Плазмиды определяют как стабильно наследуемые внехромосомные генетические элементы. Обычный компонент бактериальных клеток, но встречаются также и у низших эукариот. В большинстве случаев плазмиды -  суперскрученные ковалентно-замкнутые кольцевые молекулы ДНК. Размер от 2 до 600 т.п.н. Благодаря кольцевой структуре они не подвергаются действию экзонуклеаз. Существуют также линейные плазмиды, устойчивость которых к действию экзонуклеаз обеспечивается тем, что концы нитей их ДНК защищены белками. Клетки, приобретающие плазмиды, как правило, приобретают и новые признаки: F-плазмид (фактор пола), придающих клеткам донорные свойства; Col-плазмид, способствующих синтезу колицинов; и R-плазмид (резистентность).

13.1. Фенотипические маркеры.

- Устойчивость к антибиотикам

- устойчивость к катионам (висмута, кадмия, кобальта, ртути, свинца, сурьмы), анионам (арсеналу, арсениту), мутагенам (акридинам, этидиум-броми- ду, УФ-свету), бактериоцинам.

Клетки с плазмидами способны

- вызывать биодеградацию камфоры, ксилола, нафталина, никотин-ни- котината, n-алканов, салицилата, толуола;

- синтезировать антибиотики, бактериоцины, гемолизин, инсектициды, пигменты, поверхностные антигены, сероводород, токсины, фибринолизин;

- использовать в качестве источника углерода различные сахара и необычные аминокислоты;

- конъюгировать с реципиентными штаммами бактерий;

- индуцировать опухоли у растений; осуществлять рестрикцию и модификацию ДНК.

*Плазмиды, которые не выявляются по фенотипическим признакам, называют критическими.

Базовый репликон — минимальный участок плазмиды, достаточный для ее стабильного существования в бактериальной клетке, т. е. включающий набор генов несовместимости плазмид, контроля числа копий, репликации и сегрегации. Без него молекула не может копироваться самостоятельно.

Строение базового репликона: как я понял их тут бывает типа 3 вида

1. oriV (сайт инициации репликации) – небольшая последовательность которая распознается системой репликации и запускает этот процесс. Пример: pUC18/19, колЕ

2. oriV + rep (ген кодирующий белок, запускающий копирование(привлекает ферменты которые расплетают ДНК) плазмиды группы инкП9

3. oriV + rep + par (ген определяющий распределение плазмид по дочерним клеткам в процессе деления) колЕ2????

13.2 Классификация

На свойстве сходства базового репликона основана система классификации плазмид.

Плазмиды одной классификационной группы не могут копироваться в одной клетке(несовместимые), но плазмиды Col и p15 относятся к ондой группе и могут копироваться вместе.

По группам несовместимости(семействам):

Грам -, например у псевдомонад 14 классов плазмид, а у энтеробактерий 38(А, В, С...)

Грам + (по типу копирования) – тета-тип, сигма-тип.

Плазмиды могут наследоваться у многих типов хозяев, либо небольшого количества хозяев. Выделяют плазмиды узкого круга – используются чаще так как организованы проще, но встраиваются только в одного хозяина. Широкого круга – устроены сложнее, подходят для многих видов бактерий.

Плазмиды могут копироваться вне хромосомы или встраиваться в хромосому и копироваться в ее составе(интегральные вектора)

Принципы создания векторных систем для молекулярного клонирования (основные свойства, классификация). Особенности векторных систем для молекулярного клонирования в клетках бактерий, растений и животных.

Классификация.

 По области использования различают:

1) векторы общего назначения (клонирование генов, фрагментов ДНК),

2) векторы для экспрессии клонированных генов (синтез мРНК и белков)

3) специализированные векторы (секвенирование и мутирование генов, изучение особенностей регуляции клонированных генов, идентификация в клонируемой ДНК про моторов и других регуляторных сайтов).

По происхождению ДНК векторы делят на:

1) плазмидные (существуют в клетке и вне ее только в виде молекул ДНК),

2) фаговые (существуют в виде молекул ДНК и вирионов) и

3) гибридные (сочетают отдельные свойства плазмид и фагов).

По структуре ДНК различают кольцевые и линейные векторы.

По способу поддержания в клетке выделяют:

1) автономные (реплицируются самостоятельно)

2) интегративные (реплицируются в составе клеточной хромосомы)

По числу молекул в клетке векторы могут быть:

1) малокопийными (несколько копий)

2) мультикопийными (десятки копий).

По числу репликаторов, имеющихся в векторном геноме:

1) моно- и 2) бирепликонные (би- репликонные векторы называют также челночными, если они могут реплицироваться в клетках различных видов).

Основные свойства.

Для эффективного выполнения своей функции вектор должен отвечать определенным требованиям:

1) быть репликоном, чтобы стабильно существовать в клетке;

2) иметь селективный маркер

3) иметь, по крайней мере, один сайт клонирования для внедрения в него чужДНК.

Однако, эти требоания не жесткие. Например, ori-сайты могут отсутствовать в интегративных векторах, а селективные маркеры — в фаговых.

Все векторы в генетической инженерии создаются на основе природных молекул – плазмид и вирусов(в т.ч. бактериофаги). Именно эти молекулы могут переноситься из клетки в клетку.

В природе плазмиды передаются у бактерий. Перенос генов у бактерий осуществляется с помощью конъюгации, трансофрмации и трансудкции(с помощью бактериофагов). Поэтому в качестве основы бактериальных вектторов используются именно плазмиды.

У растений: агробактерия, содержащая Ti-плазмиды - > агробактериальная трансофрмация, используется для внесения генов в двудольные растения - > образование корональных галлов(опухоли, поражающие стебель, корни, листья), так как в ДНК растения встраиввается участок плазмиды -Т-ДНК. + вирусы.

У животных в качестве векторов используются только вирусы.