ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

 

1. Приготовить мазок из зубного налета и окрасить

простым методом — разведенным фуксином или мети-

леновой синью.

2. Приготовить мазок из бактериальной культуры и

окрасить простым методом — разведенным фуксином

или метиленовой синью.

304

ТЕМА 2

 

3. Сравнить оба мазка, обратить внимание на разные

формы бактерий, зарисовать микрокартину.

4. Приготовить препарат на предметном стекле из

смеси кишечной палочки и стафилококка для окраски

по Граму.

 

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

 

1. Назовите анилиновые краски, часто применяемые в ми-

кробиологии.

2. Что характерно для простого метода окрашивания?

3. Суть физического и химического методов фиксации пре-

паратов.

4. Назовите основные формы бактерий.

5. С какой целью изучают морфологию бактерий?

6. С какой целью применяются сложные методы окрашива-

ния?

7. В чем заключается суть окраски по Граму?

8. С какой целью применяется окраска по Граму?

9. Приведите в качестве примера грамположительные бак-

терии.

Тема 3

 

БИОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
ОБРАЗОВАНИЯ СПОР И КАПСУЛ.

МЕТОДЫ ОКРАШИВАНИЯ
СПОР И КАПСУЛ

 

 

Цель занятия. Узнать биологическое значение образования

спор и капсул. Овладеть методами окрашивания спор и кап-

сул. Овладеть методами исследования бактерий на подвиж-

ность и методами приготовления препаратов «висячая капля»

и «раздавленная капля».

Материалы и оборудование. Смыв 2–3-суточной культуры

сенной палочки, содержащей вегетативные клетки и споры.

Набор красок с пипетками для окраски спор по Златогорову;

16–18-часовая культура сенной палочки или кишечной па-

лочки в МПБ для изучения подвижности. Спиртовки, пред-

метные стекла, покровные стекла и стекла с луночкой для из-

учения подвижности, баночки с вазелином и спичкой. Банки

с дезраствором. Микроскопы, иммерсионное масло. Готовый

препарат на предметном стекле для демонстрации капсул.

Таблицы. Окраска спор по Златогорову. Окраска капсул по

Ольту. Органы движения бактерий.

для бактерий являются:

306

ТЕМА 3

3.1. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
        ОБРАЗОВАНИЯ СПОР

 

Некоторые виды палочковидных бактерий в неблаго-

приятных условиях внутри материнской клетки образу-

ют споры (эндоспоры). Неблагоприятными условиями

 

 недостаток влаги и питательных веществ;
 избыток продуктов метаболизма;

 старение бактериальной культуры.

Споры чаще образуют почвенные микроорганизмы,

поэтому почва является резервуаром спорообразующих

бактерий и источником загрязнения продуктов жи-

вотного происхождения (Bac. anthracis, Bac. subtilis,

Cl. perfringens). У бактерий в стадии споры прекраща-

ются все физиологические процессы, она находится в

состоянии анабиоза. При изменении условий появлении

пищи и влаги активизируются ферменты и спора про-

растает в вегетативную форму, для которой характерны

все физиологические формы проявления жизнидеятель-

ности: питание, дыхание и размножение.

Одна бактерия образует только одну спору, т. е. это

не размножение, а сохранение вида в неблагоприятных

условиях. Все бактерии, образующие споры, называют-

ся бациллы. Палочки, у которых диаметр спор превы-

шает ширину вегетативной клетки, принято называть

клостридиями. Бациллы бесконечно долго сохраняют-

ся в почве (возбудитель сибирской язвы), устойчивы

при обработке кислотами и щелочами, выдерживают

кипячение (возбудители столбняка, ботулизма), имеют

плотную, труднопроницаемую для красителей оболоч-

ку и простым методом не прокрашиваются, оставаясь

в виде бесцветных включений. Поэтому для окраски

спор применяют сложные методы окрашивания, осно-

ванные на применении горячих концентрированных

красок, при этом споры и вегетативные клетки одновре-

менно окрашиваются в один цвет, но при последующем

кратковременном воздействии кислотой на мазок веге-

тативные клетки обесцвечиваются, а споры, являясь

БИОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ СПОР И КАПСУЛ

307

 

кислотоустойчивыми, сохраняют цвет первой краски.

Обесцвеченные вегетативные клетки дополнительно

окрашивают.

Методика окрашивания спор по Златогорову.

1. На фиксированный мазок наносят карболовый

фуксин и красят 7–10 мин при подогревании над пламе-

нем спиртовки до появления пара, т. е. прокрашивают

споры концентрированной горячей краской.

2. Препарат обесцвечивают 2%-ным раствором сер-

ной кислоты в течение 1–3 с (за это время должны успеть

обесцветиться только вегетативные клетки, поэтому для

успешной окраски время обесцвечивания желательно

предварительно оттитровать).

3. Препарат обильно промывают водой, чтобы пре-

кратить действие кислоты.

4. Обесцвеченные вегетативные клетки докрашивают

метиленовой синью 5 мин, краску смывают водой.

Микрокартина: споры остались красные, вегетатив-

ные клетки — синие.

Наличие или отсутствие споры является третьим

признаком при определении вида.

 

3.2. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
        ОБРАЗОВАНИЯ КАПСУЛ

 

Некоторые болезнетворные бактерии, находясь в ор-

ганизме больного, вокруг клеточной стенки образуют

слизистый слой, называемый капсулой, которая имеет

консистенцию геля и при микроскопии не видна. Нали-

чие капсулы отмечают у возбудителей сибирской язвы,

диплококковой септицемии. У вирулентных бактерий,

находящихся в организме животного или человека,

капсула является фактором агрессии, так как защища-

ет бактерии от воздействия фагоцитов и специфических

антител, поэтому заболевание протекает особенно тя-

жело. У почвенных бактерий капсула во внешней среде

защищает от высыхания и бактериофагов. Среди молоч-

308

ТЕМА 3

 

нокислых бактерий имеются штаммы, образующие кап-

сулу, благодаря чему продукт приобретает слизистую,

тягучую консистенцию, эта особенность должна быть от-

ражена в названии штамма. У различных бактерий хи-

мический состав капсул различен, что позволяет диффе-

ренцировать их друг от друга при идентификации. Так,

капсульное вещество сибиреязвенной палочки содержит

полипептид D-глутаминовой кислоты, а диплококковой

септицемии — полисахарид. Капсула бактерий плохо

прокрашивается или окрашивается в другой цвет.

Для выявления капсул применяют метод окрашива-

ния по Ольту. Мазок можно приготовить из крови боль-

ного животного или из кисломолочного продукта, содер-

жащего слизистые штаммы бактерий.

Методика. На мазок наносят 2%-ный водный раствор

сафранина и красят 2 мин при подогревании в пламе-

ни спиртовки, не допуская кипения красителя, краску

смывают водой.

Микрокартина: капсула — желтая, тело бактерии —

красное.

Наличие или отсутствие капсулы является четвер-
тым признаком при определении вида.

 

3.3. ИССЛЕДОВАНИЕ БАКТЕРИЙ
        НА ПОДВИЖНОСТЬ

 

Некоторые бактерии имеют органы движения — жгу-

тики, тончайшие нити диаметром 0,02–0,04 мкм, дли-

ной до 10–20 мкм. Под световым микроскопом жгутики

не видны, так как их размеры лежат за пределами раз-

решающей способности микроскопа, их наличие можно

определить косвенным путем — бактерии изучают в жи-

вом состоянии: если они передвигаются, значит, у них

есть органы движения. Для детального изучения органов

движения применяют электронный микроскоп. Наличие

и расположение жгутиков можно изучить под световым

микроскопом, применив импрегнацию серебром, т. е.

БИОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ СПОР И КАПСУЛ

309

 

искусственно увеличив размеры жгутиков до разрешаю-

щей способности данного микроскопа.

По расположению жгутиков на теле микробной клет-

ки их можно разделить на четыре группы:

1) монотрихи — бактерии с одним жгутиком на конце;

2) лофотрихи — бактерии с пучком жгутиков на од-

ном конце;

3) амфотрихи — бактерии с пучком жгутиков на обо-

их концах;

4) перитрихи — бактерии со жгутиками по всей по-

верхности тел.

Извитые формы (спириллы и спирохеты) передви-

гаются в окружающем пространстве за счет изменения

конфигурации тела.

 

3.3.1. Методика определения подвижности бактерий
        в препаратах «висячая капля»

        и «раздавленная капля»

 

Для приготовления препарата «висячая капля», ис-

пользуют молодую 16–18-часовую бульонную культуру

изучаемых бактерий (сенная палочка, кишечная палоч-

ка), смазывают вазелином края лунки на специальном

предметном стекле с луночкой и наносят каплю взвеси

в центр покровного стекла. Предметное стекло перево-

рачивают лункой вниз и накладывают на покровное сте-

кло так, чтобы оно прилипло, а капля оказалась в цент-

ре лунки. Затем его осторожно еще раз переворачивают

покровным стеклом вверх, чтобы капля висела в цент-

ре герметично закрытой лунки. При микроскопии под

8-кратным объективом находят край капли, фиксируют

предметное стекло клеммами и переводят 40-кратный

объектив в рабочее положение (в дальнейшем можно

применить и иммерсионный). Для более контрастного

изображения надо затемнить поле зрения, прикрыв ди-

афрагму, выбрать оптимальную высоту конденсора, под-

нимая и опуская его. Подвижность хорошо видна уже

при 40-кратном увеличении, при активном движении с

помощью жгутиков бактерии пересекают все поле зре-

310

ТЕМА 3

 

ния. Старая по возрасту культура малоподвижна, при

внимательном изучении можно заметить активность

только некоторых клеток.

Для приготовления препарата «раздавленная капля»

в центр обычного предметного стекла наносят каплю ис-

следуемой культуры, которую накрывают покровным

стеклом. Изучают такой препарат так же, как вышеопи-

санный.

Наличие жгутиков является пятым признаком для

определения вида.

 

 

ЗАДАНИЯ